书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３８７４ — ２００９ 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狓狔犾犪狀犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀犳犲犲犱犪犱犱犻狋犻狏犲狊 — 犛狆犲犮狋狉狅狆犺狅狋狅犿犲狋狉犻犮犿犲狋犺狅犱 ２００９  ０５  ２６ 发布 ２００９  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口 。 本标准由中国农业大学农业部饲料工业中心 、 武汉新华扬生物有限公司 、 广东溢多利生物技术股份 有限公司负责起草 。 本标准主要起草人 ： 陆文清 、 曹云鹤 、 刘兴海 、 詹志春 、 刘亚力 、 陈清华 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３８７４ — ２００９ 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法 １ 　 范围 本标准规定了用分光光度法测定饲料添加剂中木聚糖酶的活力 。 本标准适用于饲料添加剂木聚糖酶产品 ， 最低检出量为 １０．０Ｕ ／ ｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 原理 木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖 。 还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与 ３ ， ５ 二硝基 水杨酸 （ ＤＮＳ ） 试剂发生显色反应 。 反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比 ， 而还原糖的生成 量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比 。 因此 ， 通过分光比色测定反应液颜色的强度 ， 可以计算反应液 中木聚糖酶的活力 。 在 ３７℃ 、 ｐＨ 为 ５．５０ 的条件下 ， 每分钟从浓度为 ５ｍｇ ／ ｍＬ 的木聚糖溶液中降解释放 １ μ ｍｏｌ 还原 糖所需要的酶量为一个酶活力单位 Ｕ 。 ４ 　 试剂与溶液 除特殊说明外 ， 所用的试剂均为分析纯 ， 水均为符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中规定的二级水 。 ４ ． １ 　 氢氧化钠溶液 ， 浓度为 ２００ 犵 ／ 犔 称取氢氧化钠 ２０．０ｇ 。 加水溶解 ， 定容至 １００ｍＬ 。 ４ ． ２ 　 乙酸溶液 ， 浓度为 ０ ． １ 犿狅犾 ／ 犔 吸取冰乙酸 ０．６０ｍＬ 。 加水溶解 ， 定容至 １００ｍＬ 。 ４ ． ３ 　 乙酸钠溶液 ， 浓度为 ０ ． １ 犿狅犾 ／ 犔 称取三水乙酸钠 １．３６ｇ 。 加水溶解 ， 定容至 １００ｍＬ 。 ４ ． ４ 　 乙酸  乙酸钠缓冲溶液 ， 浓度为 ０ ． １ 犿狅犾 ／ 犔 ， 狆犎 为 ５ ． ５０ 称取三水乙酸钠 ２３．１４ｇ ， 加入冰乙酸 １．７０ｍＬ 。 再加水溶解 ， 定容至 ２０００ｍＬ 。 测定溶液的 ｐＨ 。 如果 ｐＨ 偏离 ５．５０ ， 再用乙酸溶液 （ ４．２ ） 或乙酸钠溶液 （ ４．３ ） 调节至 ５．５０ 。 ４ ． ５ 　 木糖溶液 （ 犆 ５ 犎 １０ 犗 ５ ）， 浓度为 １０ ． ０ 犿犵 ／ 犿犔 称取无水木糖 １．０００ｇ ， 加乙酸  乙酸钠缓冲溶液 （ ４．４ ） 溶解 ， 定容至 １００ｍＬ 。 ４ ． ６ 　 木聚糖溶液 ， 浓度为 １００ 犿犵 ／ 犿犔 　　 １ ） 　 ＳｉｇｍａＸ０６２７ 是商品名 ， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者 ， 并不表示对该产品的认可 。 如果其他产品 能有相同的效果 ， 则可使用这些等效的产品 。 　　 称取木聚糖 （ ＳｉｇｍａＸ０６２７ １ ） ） １．００ｇ ， 加入 ０．３２ｇ 氢氧化钠 ， 再加入 ９０ｍＬ 水 ， 磁力搅拌 ， 同时缓慢 １ 犌犅 ／ 犜 ２３８７４ — ２００９ 加热 ， 直至木聚糖完全溶解 。 然后停止加热 ， 继续搅拌 ３０ｍｉｎ ， 加入 ０．５ｍＬ 冰乙酸 。 继续磁力搅拌 ， 测 定其 ｐＨ 。 如果 ｐＨ 为 ５．５０ ， 用乙酸  乙酸钠缓冲溶液 （ ４．４ ） 定容至 １００ｍＬ 。 如果 ｐＨ 偏离 ５．５０ ， 再用乙 酸溶液 （ ４．２ ） 或乙酸钠溶液 （ ４．３ ） 调节至 ５．５０ ， 然后再用乙酸  乙酸钠缓冲溶液 （ ４．４ ） 定容至 １００ｍＬ 。 使 用前适当摇匀 。 ４℃ 避光保存 ， 有效期为 １２ｈ 。 ４ ． ７ 　 犇犖犛 试剂 称取 ３ ， ５ 二硝基水杨酸 ３．１５ｇ ， 加水 ５００ｍＬ ， 搅拌 ３ｓ ～ ５ｓ ， 水浴至 ４５℃ 。 然后逐步加入 １００ｍＬ 氢氧化钠溶液 （ ４．１ ）， 同时不断搅拌 ， 直到溶液清澈透明 （ 注意 ： 在加入氢氧化钠过程中 ， 溶液温度不要超 过 ４８℃ ）。 再逐步加入四水酒石酸钾钠 ９１．０ｇ 、 苯酚 ２．５０ｇ 和无水亚硫酸钠 ２．５０ｇ 。 继续 ４５℃ 水浴 加热 ， 同时补加水 ３００ｍＬ ， 不断搅拌 ， 直到加入的物质完全溶解 。 停止加热 ， 冷却至室温后 ， 用水定容至 １０００ｍＬ 。 用烧结玻璃过滤器过滤 。 取滤液 ， 储存在棕色瓶中 ， 避光保存 。 室温下存放 ７ｄ 后方可使 用 ， 有效期为 １８０ｄ 。 ５ 　 仪器与设备 ５ ． １ 　 实验室用样品粉碎机或碾钵 。 ５ ． ２ 　 分样筛 ： 孔径为 ０．２５ｍｍ 。 ５ ． ３ 　 分析天平 ： 感量 ０．００１ｇ 。 ５ ． ４ 　 ｐＨ 计 ： 精确至 ０．０１ 。 ５ ． ５ 　 磁力搅拌器 ： 附加热功能 。 ５ ． ６ 　 电磁振荡器 。 ５ ． ７ 　 烧结玻璃过滤器 ： 孔径为 ０．４５ μ ｍ 。 ５ ． ８ 　 离心机 ： 最大离心加速度不小于 ２０００ 犵 。 ５ ． ９ 　 恒温水浴锅 ： 温度控制范围在 ３０℃ ～ ６０℃ 之间 ， 精度为 ０．１℃ 。 ５ ． １０ 　 秒表 ： 每小时误差不超过 ５ｓ 。 ５ ． １１ 　 可见分光光度计 。 ５ ． １２ 　 移液器 ： 精度为 １ μ Ｌ 。 ６ 　 绘制标准曲线 ６ ． １ 　 吸取乙酸  乙酸钠缓冲溶液 （ ４．４ ） ４．０ｍＬ ， 加入 ＤＮＳ 试剂 （ ４．７ ） ５．０ｍＬ ， 沸水浴加热 ５ｍｉｎ 。 用自 来水冷却至室温 ， 用水定容至 ２５．０ｍＬ ， 制成标准空白样 。 ６ ． ２ 　 分别吸取木糖溶液 （ ４．５ ） １．００ｍＬ 、 ２．００ｍＬ 、 ３．００ｍＬ 、 ４．００ｍＬ 、 ５．００ｍＬ 、 ６．００ｍＬ 和 ７．００ｍＬ ， 分别用缓冲溶液 （ ４．４ ） 定容至 １００ｍＬ ， 配制成浓度为 ０．１０ｍｇ ／ ｍＬ 、 ０．２０ｍｇ ／ ｍＬ 、 ０．３０ｍｇ ／ ｍＬ 、 ０．４０ｍｇ ／ ｍＬ 、 ０．５０ｍｇ ／ ｍＬ 、 ０．６０ｍｇ ／ ｍＬ 和 ０．７０ｍｇ ／ ｍＬ 木糖标准溶液 。 ６ ． ３ 　 分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各 ２．００ｍＬ （ 做两个平行 ）， 分别加入到刻度试管中 ， 再分 别加入 ２．０ｍＬ 缓冲液 （ ４．４ ） 和 ５．０ｍＬＤＮＳ 试剂 （ ４．７ ）。 电磁振荡 ３ｓ ～ ５ｓ ， 沸水浴加热 ５ｍｉｎ 。 然后 用自来水冷却到室温 ， 再用水定容至 ２５ｍＬ 。 以标准空白样为对照调零 ， 在 ５４０ｎｍ 处测定吸光度 犃 值 。 以木糖浓度为 Ｙ 轴 、 吸光度 Ａ 值为 Ｘ 轴 ， 绘制标准曲线 。 每次新配制 ＤＮＳ 试剂均需要重新绘制 标准曲线 。 ７ 　 反应用酶液的制备 ７ ． １ 　 固体样品的反应用酶液制备 按照附录 Ａ 中建议的称样量称取试样两份 ， 精确至 ０．００１ｇ 。 加入 ４０ｍＬ 乙酸  乙酸钠缓冲溶液 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３８７４ — ２００９ （ ４．４ ）。 磁力搅拌 ３０ｍｉｎ ， 再用缓冲溶液 （ ４．４ ） 定容至 １００ｍＬ ， 在 ４℃ 条件下避光保存 １ｈ ～ ２ｈ 。 上离 心机 （ ５．８ ） １０００ 犵 离心 ３ｍｉｎ ～ ５ｍｉｎ ， 取上清液 ， 再用缓冲溶液 （ ４．４ ） 做适当稀释 （ 稀释后的待测酶液中 木聚糖酶活力最好能控制在 ０．０４Ｕ ／ ｍＬ ～ ０．１０Ｕ ／ ｍＬ 之间 ）。 ７ ． ２ 　 液体样品的反应用酶液制备 液体样品可以直接用乙酸  乙酸钠缓冲溶液 （ ４．４ ） 进行稀释 、 定容 （ 稀释后的酶液中木聚糖酶活力最 好能控制在 ０．０４Ｕ ／ ｍＬ ～ ０．１０Ｕ ／ ｍＬ 之间 ）。 如果稀释后酶液的 ｐＨ 偏离 ５．５０ ， 需要用乙酸溶液 （ ４．２ ） 或乙酸钠溶液 （ ４．３ ） 调节校正至 ５．５０ ， 然后再用缓冲溶液 （ ４．４ ） 做适当稀释定容 。 ８ 　 测定步骤 吸取 １０．０ｍＬ 木聚糖溶液 （ ４．６ ）， ３７℃ 平衡 ２０ｍｉｎ 。 吸取 １０．０ｍＬ 经过适当稀释的酶液 （ ７．１ 或 ７．２ ）， ３７℃ 平衡 １０ｍｉｎ 。 吸取 ２．００ｍＬ 经过适当稀释的酶液 （ 已经过 ３７℃ 平衡 ）， 加入到刻度试管中 ， 再加入 ５ｍＬＤＮＳ 试 剂 （ ４．７ ）， 电磁振荡 ３ｓ ～ ５ｓ 。 然后加入 ２．０ｍＬ 木聚糖溶液 （ ４．６ ）