书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３８７７ — ２００９ 饲料酸化剂中柠檬酸 、 富马酸和 乳酸的测定 　 高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犻狋狉犻犮犪犮犻犱 ， 犳狌犿犪狉犻犮犪犮犻犱犪狀犱犾犪犮狋犻犮犪犮犻犱犻狀犳犲犲犱犪犮犻犱犻犳犻犲狉 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ２００９  ０５  ２６ 发布 ２００９  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为规范性附录 ， 附录 Ｂ 为资料性附录 。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ７６ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 上海市饲料质量监督检验站 、 上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研 究所 。 本标准主要起草人 ： 赵志辉 、 黄志英 、 顾赛红 、 杨海锋 、 林淼 、 白冰 、 雷萍 、 凤懋熙 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３８７７ — ２００９ 饲料酸化剂中柠檬酸 、 富马酸和 乳酸的测定 　 高效液相色谱法 １ 　 范围 本标准规定了测定饲料酸化剂中柠檬酸 、 富马酸和乳酸含量的高效液相色谱法 。 本标准适用于饲料酸化剂中柠檬酸 、 富马酸和乳酸含量的测定 。 本方法的定量限为 ： 柠檬酸 ８００ｍｇ ／ ｋｇ 、 富马酸 ８．０ｍｇ ／ ｋｇ 、 乳酸 ８００ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６０１ 　 化学试剂 　 标准滴定溶液的制备 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ３ 　 原理 试样中柠檬酸 、 富马酸和乳酸加水超声提取后 ， 稀释至适当的浓度 ， 用高效液相色谱仪进行测定 ， 外 标法计算柠檬酸 、 富马酸和乳酸的含量 。 ４ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 本方法所用试剂均为分析纯 ， 水为符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 二级规定的用水 。 ４ ． １ 　 乙腈 ： 色谱纯 。 ４ ． ２ 　 磷酸 ： 色谱纯 。 ４ ． ３ 　 ０．１％ 磷酸溶液 ： 准确吸取 １．００ｍＬ 磷酸 （ ４．２ ）， 用符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级用水溶解并定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． ４ 　 柠檬酸标准品 ： 纯度 ≥ ９９．５％ 。 ４ ． ５ 　 富马酸标准品 ： 纯度 ≥ ９９．５％ 。 ４ ． ６ 　 柠檬酸标准储备液 ： 准确称取柠檬酸标准品 ０．５０２５ｇ 于 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 用水溶解并定容至刻 度 。 此溶液浓度为 １０．０ｍｇ ／ ｍＬ ， ４℃ 条件下储藏 ， 保存期 ３ 个月 。 ４ ． ７ 　 富马酸标准储备液 ： 准确称取 ０．１０００ｇ 富马酸标准品于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水溶解并定容至刻 度 。 此溶液浓度为 １．０ｍｇ ／ ｍＬ ， ４℃ 条件下储藏 ， 保存期 ３ 个月 。 ４ ． ８ 　 乳酸标准储备液 ： 制备和标定方法见附录 Ａ 。 ４ ． ９ 　 混合标准储备液 ： 取 １０．０ｍＬ 柠檬酸标准储备液 （ ４．６ ）， １．０ｍＬ 富马酸标准储备液 （ ４．７ ） 和 １０．０ｍＬ 乳酸标准储备液 （ ４．８ ） 于 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容至刻度 ， 混匀 。 ４℃ 条件下储藏 ， 保存期 １ 个月 。 ４ ． １０ 　 混合标准工作液 ： 准确吸取 ０．１０ｍＬ 、 ０．２５ｍＬ 、 ０．５０ｍＬ 、 １．００ｍＬ 、 ２．５０ｍＬ 、 ５．００ｍＬ 、 １０．００ｍＬ 混合标准储备液 （ ４．９ ） 于 １０．０ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容至刻度 ， 混匀 。 此为混合标准工作液 ， 现配现用 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２３８７７ — ２００９ ５ 　 仪器和设备 ５ ． １ 　 实验室常用仪器设备 。 ５ ． ２ 　 分析天平 ： 感量为 ０．０００１ｇ 。 ５ ． ３ 　 超声波清洗器 。 ５ ． ４ 　 微孔滤膜 ： 孔径 ０．４５ μ ｍ 。 ５ ． ５ 　 高效液相色谱仪 （ 配有紫外检测器或二极管阵列检测器 ）。 ６ 　 试样的制备 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 规定 ， 取有代表性的样品 １ｋｇ ， 四分法缩减取 ２００ｇ ， 装入磨口瓶中备用 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 试样溶液制备 称取试样 １ｇ ～ ５ｇ （ 精确至 ０．０００１ｇ ）， 置于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 加 ６０ｍＬ 水 ， 在 ５０℃ 水浴中超声提 取 ２０ｍｉｎ ， 冷却至室温 ， 用水定容至刻度 ， 摇匀 ， 过滤 。 取滤液稀释 ， 使最后稀释液中各种有机酸的浓度 均落在 ４．１０ 的工作曲线之内 。 取部分稀释液过 ０．４５ μ ｍ 滤膜 ， 滤液作为试样溶液 。 ７ ． ２ 　 高效液相色谱条件 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱 ， 长 ２５０ｍｍ ， 内径 ４．６ｍｍ ， 粒度 ５ μ ｍ （ 极性色谱柱 ）。 柱温 ： ３５℃ 。 流动相 ： 乙腈 ＋ 磷酸溶液 （ ４．３ ） ＝２．５＋９７．５ （ 体积比 ）。 流速 ： １．０ｍＬ ／ ｍｉｎ 。 检测波长 ： ２１０ｎｍ 。 进样量 ： ２０ μ Ｌ 。 ７ ． ３ 　 液相色谱测定 分别取混合标准工作液 （ ４．１０ ） 和试样溶液 （ ７．１ ）， 按 ７．２ 列出的条件进行液相色谱分析测定 。 以混 合标准工作液作多点校准 ， 并用色谱峰面积积分值定量 。 测定中应调整试样溶液的浓度 ， 使柠檬酸 、 富 马酸和乳酸的积分值分别落在标准曲线的相应范围内 。 ８ 　 结果计算与表述 试样中柠檬酸 、 富马酸和乳酸的含量 犡 ， 以质量分数表示 ， 按式 （ １ ） 计算 ： 犡 ＝ 犮 × 犞 × 狀 犿 × １００００００ × １００％ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犮 ——— 由标准曲线得出的试样液中柠檬酸或富马酸或乳酸的浓度 ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 试样液总体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 狀 ——— 稀释倍数 ； 犿 ——— 试样的质量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 测定结果用平行测定的算术平均值表示 ， 保留 ３ 位有效数字 。 ９ 　 重复性 在重复性条件下 ， 完成两个平行测定的结果的相对偏差不大于 ５％ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３８７７ — ２００９ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 乳酸标准储备溶液的制备和标定 犃 ． １ 　 试剂和材料 犃 ． １ ． １ 　 乳酸 ： 纯度约为 ９０％ 。 犃 ． １ ． ２ 　 ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 氢氧化钠标准滴定溶液 ： 按 ＧＢ ／ Ｔ６０１ 配制和标定 。 犃 ． １ ． ３ 　 １％ 酚酞指示剂溶液 ： １ｇ 酚酞溶于 ６０ｍＬ９５％ 乙醇中 ， 用水稀释至 １００ｍＬ 。 犃 ． ２ 　 仪器和设备 犃 ． ２ ． １ 　 电热套 ： ５００ｍＬ 。 犃 ． ２ ． ２ 　 圆底烧瓶 ： ５００ｍＬ 。 犃 ． ２ ． ３ 　 球形冷凝管 ： １００ｍＬ 。 犃 ． ３ 　 制备和标定 称取乳酸约 ３．０ｇ 于 ５００ｍＬ 圆底烧瓶中 ， 加 ２７０ｍＬ 水 ， 装上球形冷凝管 ， 接通冷却水 ， 加热回流 １５ｈ ， 冷却至室温 。 移取 ２０ｍＬ 溶液 ， 加 ４０ｍＬ ～ ６０ｍＬ 水及 ０．２ｍＬ１％ 酚酞指示剂 ， 用 ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 氢 氧化钠标准滴定溶液滴定至微红色 ３０ｓ 不褪色 ， 记录消耗 ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数 （ 犞 １ ）。 乳酸标准储备液的浓度 犮 ｓ ， 单位为微克每毫升 （ μ ｇ ／ ｍＬ ）， 按式 （ Ａ．１ ） 计算 ： 犮 ｓ ＝ 犮 × （ 犞 １ － 犞 ２ ） 犞 ０ × ９０ ． ０８ × １０００ …………………………（ Ａ ． １ ） 　　 式中 ： 　 犮 ——— 氢氧化钠溶液的浓度 ， 单位为摩尔每升 （ ｍｏｌ ／ Ｌ ）； 犞 １ ——— 滴定乳酸溶液所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犞 ２ ——— 空白试验时所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犞 ０ ——— 乳酸溶液的体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； ９０．０８ ——— 乳酸的摩尔质量 。 此标准储备液在 ４℃ 下可保存 ３ 个月 。 犌犅 ／ 犜 ２３８７７ — ２００９ 书书书 犌犅／犜２３８７７—２００９ 附　录　犅 （资料性附录） 柠檬酸、富马酸和乳酸标准品的色谱图 　　柠檬酸、富马酸和乳酸标准品的色谱图见图Ｂ．１。 图犅．１　 标准溶液色谱图 ９００２ — ７７８３２犜／犅犌