书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犅 ４６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２３８８１ — ２００９ 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犳犲犲犱犮犲犾犾狌犾犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔 — 犉犻犾狋犲狉狆犪狆犲狉犪狊狊犪狔犿犲狋犺狅犱 ２００９  ０５  ２６ 发布 ２００９  １０  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ： 国家饲料质量监督检验中心 （ 武汉 ）。 本标准主要起草人 ： 何凤琴 、 杨林 、 钱 窻 、 刘小敏 、 屈利文 、 黄婷 、 颜克亮 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２３８８１ — ２００９ 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法 １ 　 范围 本标准规定了以滤纸为底物 ， 用还原糖比色法测定饲用纤维素酶活性的方法 。 本标准适用于饲用纤维素酶活性的测定 ， 定量检测限为 ０．０２Ｕ ／ ｍＬ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 　 滤纸纤维素酶活性单位 　 犳犻犾狋犲狉狆犪狆犲狉犮犲犾犾狌犾犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔狌狀犻狋 在 ３７℃ ， ｐＨ５．５ ， 反应 ６０ｍｉｎ 的条件下 ， 每分钟降解滤纸释放 １ μ ｍｏｌ 葡萄糖所需的酶量 ， 定义为 一个滤纸纤维素酶活性单位 ， 以 Ｕ 表示 。 ４ 　 原理 纤维素酶水解滤纸产生的纤维二糖 、 葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的 ３ ， ５ 二硝基水杨酸还原 ， 生成棕红色的氨基化合物 ， 在 ５４０ｎｍ 波长处有最大吸收 ， 在一定范围内酶解产生的还原糖的量与反应 液的吸光值成正比 。 ５ 　 试剂和材料 本标准使用的试剂均为分析纯 ， 水均为符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中规定的二级水 。 ５ ． １ 　 酒石酸钾钠 （ Ｃ ４ Ｈ ４ ＫＮａＯ ６ · ４Ｈ ２ Ｏ ）。 ５ ． ２ 　 苯酚 。 ５ ． ３ 　 亚硫酸钠 。 ５ ． ４ 　 氢氧化钠溶液 （ ２００ｇ ／ Ｌ ）： 称取氢氧化钠 ２０．０ｇ ， 加 １００ｍＬ 水溶解 。 ５ ． ５ 　 柠檬酸溶液 （ ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取柠檬酸 （ Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ７ · Ｈ ２ Ｏ ） ２．１０ｇ ， 加水溶解定容至 １００ｍＬ 。 ５ ． ６ 　 柠檬酸钠溶液 （ ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取柠檬酸钠 （ Ｎａ ３ Ｃ ６ Ｈ ５ Ｏ ７ · ２Ｈ ２ Ｏ ） ２．９４ｇ ， 加水溶解定容至 １００ｍＬ 。 ５ ． ７ 　 柠檬酸盐缓冲液 （ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ５．５ ）： 称取柠檬酸 （ Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ７ · Ｈ ２ Ｏ ） １０．５ｇ ， 加入氢氧化钠 ５．０ｇ ， 再加 ８００ｍＬ 水溶解 ， 用柠檬酸溶液 （ ５．５ ） 或柠檬酸钠溶液 （ ５．６ ） 调节 ｐＨ 至 ５．５ ， 再用水定容至 １０００ｍＬ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２３８８１ — ２００９ ５ ． ８ 　 Ｗｈａｔｍａｎ１ 号滤纸条 （ １．０ｃｍ×６．０ｃｍ ）。 ５ ． ９ 　 ＤＮＳ 试剂 ： 称取 ３ ， ５ 二硝基水杨酸 ３．１５ｇ ， 加水 ５００ｍＬ 搅拌溶解 ， 水浴至 ４５℃ ， 然后逐步加入氢 氧化钠溶液 （ ５．４ ） １００ｍＬ ， 同时不断搅拌 ， 直至完全溶解 ， 再逐步加入酒石酸钾钠 （ ５．１ ） ９１．０ｇ 、 苯酚 （ ５．２ ） ２．５０ｇ 和亚硫酸钠 （ ５．３ ） ２．５０ｇ ， 搅拌至溶解 ， 冷却到室温后 ， 定容至 １０００ｍＬ 。 过滤 ， 取滤液贮 存于棕色瓶中 ， 避光保存 。 室温下存放 ７ｄ 后可以使用 ， 有效期为 ６ 个月 。 警告 ： 处理酸碱和配制 犇犖犛 试剂时 ， 应在通风橱或通风良好的房间进行 ， 戴上保护眼镜和乳胶手 套 ， 一旦皮肤或眼睛接触了上述物质 ， 及时用大量的水冲洗 。 ５ ． １０ 　 葡萄糖标准溶液 （ １０．０ｍｇ ／ ｍＬ ）： 称取经 １０５℃ 烘至恒量的无水葡萄糖约 １ｇ ， 精确至 ０．０００１ｇ ， 加柠檬酸盐缓冲溶液 （ ５．７ ） 溶解 ， 定容至 １００ｍＬ 。 ６ 　 仪器与设备 除常用实验室设备外 ， 其他仪器设备如下 。 ６ ． １ 　 分样筛 ： 孔径为 ０．２５ｍｍ （ ６０ 目 ）。 ６ ． ２ 　 分析天平 ： 感量为 ０．０００１ｇ 。 ６ ． ３ 　 ｐＨ 计 ： 精确至 ０．０１ 。 ６ ． ４ 　 磁力搅拌器 ： 附加热功能 。 ６ ． ５ 　 电磁振荡器 。 ６ ． ６ 　 离心机 。 ６ ． ７ 　 恒温水浴锅 。 ６ ． ８ 　 秒表 。 ６ ． ９ 　 分光光度计 。 ６ ． １０ 　 移液器 ： 精度为 １ μ Ｌ 。 ７ 　 试样的制备 按 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 采样 ， 按 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 选取样品至少 ５００ｇ ， 四分法缩减至 １００ｇ ， 磨碎 ， 通过 ０．２５ｍｍ 孔筛 ， 混匀密闭容器中 ， 低温保存 。 ８ 　 测定 ８ ． １ 　 试样溶液的准备 称取 ０．２ｇ ～ ４ｇ 试样 ， 精确至 ０．０００１ｇ ， 加入 ４０ｍＬ 柠檬酸盐缓冲液 （ ５．７ ）， 磁力搅拌 ３０ｍｉｎ ， 再 用柠檬酸盐缓冲液 （ ５．７ ） 定容至 １００ｍＬ ， 在 ４℃ 条件下避光保存 ２４ｈ 。 摇匀 ， 取 ３０ｍＬ ～ ５０ｍＬ ， 以 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ 。 取 ５．００ｍＬ 上清液 ， 用柠檬酸盐缓冲液 （ ５．７ ） 做二次稀释 （ 稀释后的待测酶液 中纤维素酶活性应控制在 ０．０４Ｕ ／ ｍＬ ～ ０．１８Ｕ ／ ｍＬ 之间 ）。 液体样品可以直接用柠檬酸盐缓冲液 （ ５．７ ） 进行稀释 ， 定容 （ 稀释后的酶液中纤维素酶活性应控制 在 ０．０４Ｕ ／ ｍＬ ～ ０．１８Ｕ ／ ｍＬ 之间 ）。 如果稀释后的酶液 ｐＨ 偏离 ５．５ ， 需重新调节 ｐＨ 为 ５．５ ， 用柠檬 酸盐缓冲液 （ ５．７ ） 稀释定容 。 ８ ． ２ 　 标准曲线 ８ ． ２ ． １ 　 分别量取葡萄糖标准溶液 （ ５．１０ ） ０．００ｍＬ 、 ２．００ｍＬ 、 ３．００ｍＬ 、 ４．００ｍＬ 、 ６．００ｍＬ 、 ８．００ｍＬ 、 １０．００ｍＬ ， 分别用柠檬酸盐缓冲溶液 （ ５．７ ） 定容至 ５０ｍＬ ， 配成浓度为 ０．００ｍｇ ／ ｍＬ ～ ２．００ｍｇ ／ ｍＬ 的 葡萄糖标准系列 。 ８ ． ２ ． ２ 　 分别吸取葡萄糖标准溶液 （ ８．２．１ ） 各 １．００ｍＬ 于 ２５ｍＬ 容量瓶中 ， 各加 ２．００ｍＬ 水和 ２．００ｍＬ ＤＮＳ 试剂 （ ５．９ ）， 沸水浴 ５ｍｉｎ 。 冷却至室温 ， 用水定容至 ２５ｍＬ ， 在 ５４０ｎｍ 波长下比色 ， 以吸光度作横 坐标 ， 对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标 ， 列出直线回归方程 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２３８８１ — ２００９ ８ ． ３ 　 酶活性的测定 ８ ． ３ ． １ 　 吸取 １０．０ｍＬ 经过适当稀释的酶液 （ ８．１ ）， ３７℃ 平衡 １０ｍｉｎ 。 ８ ． ３ ． ２ 　 在 ２５ｍＬ 具塞比色管中加入滤纸条 （ ５．８ ）——— 滤纸条须对称剪成 ３２ 片并全部放入 ， 加 １．０ｍＬ 柠檬酸盐缓冲液 （ ５．７ ） 浸润滤纸片 ， ３７℃ 水浴平衡 １０ｍｉｎ ， 再依次加入 ２．００ｍＬＤＮＳ 试剂 （ ５．９ ）， ０．５０ｍＬ 酶液 （ ８．３．１ ）， ５ｍＬ 水 ， 电磁振荡 ３ｓ ～ ５ｓ ， ３７℃ 水浴中保温 ６０ｍｉｎ （ 用秒表控制 ）， 然后在沸水 浴中煮沸 ５ｍｉｎ ， 冷却至室温 ， 用水定容至 ２５ｍＬ ， 在 ５４０ｎｍ 波长处测定校准值 犃 ０ 。 ８ ． ３ ． ３ 　 在 ２５ｍＬ 具塞比色管中加入滤纸条 （ ５．８ ）——— 滤纸条须对称剪成 ３２ 片并全部放入 ， 加 １．０ｍＬ 柠檬酸盐缓冲液 （ ５．７ ） 浸润滤纸片 ， ３７℃ 水浴平衡 １０ｍｉｎ ， 再依次加入 ０．５０ｍＬ 酶液 （ ８．３．１ ）， ５ｍＬ 水 ， 电磁振荡 ３ｓ ～ ５ｓ ， ３７℃ 水浴中保温 ６０ｍｉｎ （ 用秒表控制 ）， 加 ２．００ｍＬＤＮＳ 试剂 （ ５．９ ）， 然后在沸水浴 中煮沸 ５ｍｉｎ ， 冷却至室温 ， 用水定容至 ２５ｍＬ 。 在 ５４０ｎｍ 波长处测定吸光度 犃 １ 。 ９ 　 结果计算 ９ ． １ 　 试样中滤纸纤维素酶活性以 犡 表示 ， 单位为酶活性单位每克 （ Ｕ ／ ｇ ）， 按式 （ １ ） 计算 ： 犡 ＝ 犿 犕 × 狋 × １０００ × 狀 …………………………（ １ ） 　　 式 （ １ ） 中 ： 犡 ——— 试样纤维素酶的活性 ， 单位为酶活性单位每克 （ Ｕ ／ ｇ ）； 犿 ———