食用菌病害检疫鉴定方法 Diagnostic protocol for diseases in edible mushrooms  ICS  65.020.20 CCS  B 16   中华人民共和国国家标准 GB/T 44610—2024 2024-09-2 9发布 2025-04-0 1实施     国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发 布前　　言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC 271）提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人：王聪、姜帆、吴品珊、田茜。     GB/T 44610—2024     Ⅰ 食用菌病害检疫鉴定方法 1　范围   本文件描述了食用菌病害的检疫鉴定方法。 本文件适用于检测和鉴定国内生产和进口的各类食用菌子实体的真菌病害、细菌病害和病毒病害。 2　规范性引用文件   下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 12728　食用菌术语 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 GB/T 27402　实验室质量控制规范　植物检疫 GB/T 27403　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测 3　术语和定义   GB/T 12728界定的术语和定义适用于本文件。 4　缩略语   下列缩略语适用于本文件。 Ct：循环阈值（Cycle Threshold） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） OD：光密度（Optical Density） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） PDA：马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） RT﹘PCR：反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription﹘Polymerase Chain Reaction） 5　总体要求   根据病害种类的不同，一般根据形态学特征、分子生物学特征、致病性特征、生理生化特征等进行 种类鉴定，应采用多种检测方法综合进行结果判定。 在整个试验操作过程中应采用安全有效的防护措施，具体要求应符合GB 19489、GB/T 27402、 GB/T 27403的规定。 GB/T 44610—2024     1 6　仪器及用具  6.1　仪器设备   6.1.1　生物光学显微镜。 6.1.2　电子显微镜。 6.1.3　低温冰箱。 6.2　试验用具   6.2.1　解剖针。 6.2.2　标签。 6.2.3　镊子。 6.2.4　PCR管（0.2 mL）。 6.3　试剂   除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3.1　水：GB/T 6682，三级。 6.3.2　琼脂糖（C10H15N3O3）。 7　现场取样   宜挑选子实体表面有腐烂、斑点、变色、霉层、畸形等症状的样品，如无明显症状，尽量从不同部 位多点取样，用标签做好标记，带回实验室进行检测鉴定。常见重要食用菌病害症状描述见附录A。 8　病害检疫鉴定  8.1　形态学鉴定  8.1.1　真菌病害   若发病处可见病菌，则直接用镊子或解剖针挑取寄主发病处的病菌，或取分离纯化培养生长5 d～ 7 d后的病菌平板培养物，在普通生物光学显微镜下观察病原菌的形态特征。 在10 × 20、10 × 40放大倍数下进行观测，随机选取10个～15个视野，测量并观察病原菌无性态 （如分生孢子器、分生孢子等）以及有性态（如子囊壳、子囊孢子等）的大小、形态、颜色等，并进行 数码显微拍摄对测量数值进行记录。对于分离培养的病菌，同时观察菌落的形态、颜色变化等，拍照留 存并对病原菌进行类别判定。 真菌的分离、纯化及保存方式见附录B。 8.1.2　细菌病害   对于疑似细菌性病害在进行病原分离之前，先切取食用菌发病部分组织做“细菌溢”检查，如在光 学显微镜下观察到明显喷菌现象，再进行细菌的组织分离。 将食用菌发病部位剪成小块（约0.2 cm × 0.2 cm）进行分离纯化，革兰氏染色，观察其菌体；还 可通过相应的染色方法观察其是否具有鞭毛、荚膜等，具体方法见附录C。对所观察的形态特征进行拍 照留存，并对病原菌进行类别判定。 细菌的分离、纯化及保存方式见附录B。 GB/T 44610—2024     2 8.1.3　病毒病害   对于病毒病害，通过粗提的方法得到子实体的病毒粒子，对其进行负染，借助电子显微镜观察其形 态特征，获取病毒粒子的形态大小、内部结构和有无包膜等信息。对所观察的形态特征进行拍照留存， 对病毒进行类别判定。 8.2　分子生物学检测  8.2.1　核酸提取   取分离纯化得到的真菌或细菌菌落进行DNA提取，疑似病毒病害的样品一般进行DNA和RNA提 取。核酸提取方法可采用CTAB法、Trizol法、试剂盒法等，按照不同提取方法的说明书操作。核酸提 取后检测核酸浓度和纯度，并做好记录，纯度较高的DNA OD260/OD280值（OD260指核酸在260 nm的 吸光值，OD280指蛋白质在280 nm的吸光值）应为1.7～1.9，纯度较高的RNA OD260/OD280值应为 1.8～2.0。提取后的核酸在4 ℃冰箱保存备用，长期保存置于-20 ℃或-80 ℃冰箱。 8.2.2　PCR扩增   根据检测目的和对象的不同，可采用核酸序列测定、常规PCR、实时荧光PCR以及RT﹘PCR等不 同的PCR扩增方法。根据实际情况，选择一种或多种分子检测方法。 对于非靶向检测，采用核酸序列测定的方法，一般适用于真菌病害和细菌病害。常用的扩增引物见 附录D，具体反应条件和程序的设置，根据不同引物的退火温度以及PCR反应酶的说明，进行适当调 整。反应过程应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，在阳性 对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如待测样品出现目的条带，则将PCR产物送至测序 公司进行双向测序。 对于靶向检测，可选择常规PCR、实时荧光PCR或RT﹘PCR等方法。扩增引物/探针选择待测目标 物种的特异性引物/探针，根据不同引物/探针的退火温度以及PCR反应酶的说明，具体反应条件和程序 的设置可进行适当调整。反应过程以待检目标病原物的菌株/毒株或目标病原菌的质粒作为阳性对照、 健康组织的DNA作为阴性对照、水作为空白对照。扩增结束后，常规PCR方法进行琼脂糖凝胶电泳检 测，实时荧光PCR方法读取Ct值。 8.2.3　结果分析   对于采用核酸序列测定方法的非靶向检测，将测序公司返回的单峰序列进行拼接，将拼接好的序列 去除引物后，进行Nucleotide BLAST序列比对，同时构建系统发育树。综合序列比对的相似度和系统发 育树的拓扑结构进行种类判定。如查询序列与数据库中已知序列相似度高（一般选择不小于98.0%作为 阈值）且查询序列与所有目标物种序列都聚为一个单系分枝，则可判定查询序列为该目标物种；否则， 应结合形态学特征进行综合判定。 对于采用常规PCR、实时荧光PCR或RT﹘PCR等方法的靶向检测，在阳性对照、阴性对照和空白 对照结果均正常的情况下，如待检测样品产生特异性扩增条带，且该条带与阳性对照条带长度一致，则 判定检测结果为阳性，样品种类为靶向目标物种；或在反应进行40个循环的前提下，如Ct 值小于30， 则判定检测结果为阳性，样品种类为靶向目标物种。 8.3　致病性测定   按照科赫氏法则接种，测定病原菌的致病性，具体方法见附录E。 8.4　生理生化测定   对于细菌病害，根据细菌在代谢过程中所产生的合成或分解产物的不同，将分离纯化得到的细菌接 GB/T 44610—2024     3 种于特定的培养物或检测管，通过产酸、产气、颜色变化等反应，检测细菌的耐盐性、好氧性或厌氧 性、对碳素化合物的利用和分解能力、对氮素化合物的利用和分解能力、对大分子化合物的分解能力 等，以此确定细菌的种属。具体测定指标见附录C。 快速鉴定可借助生化测定试剂盒、微生物鉴定分析系统（BIOLOG）等。 9　结果判定   综合形态学鉴定、分子生物学检测、致病性测定和/或生理生化测定结果，进行结果判定。如多种 检测方法的鉴定结果均符合某一病原菌的性状，即可判定病原菌的种类和判断出病害。常见食用菌病害 类型和病原物信息见A.4。 10　结果记录   对样品的基本信息、所采用的检测方法及依据、使用的仪器设备、检测结果、结果判定、检测人员 信息、检测日期、检测单位等进行详细记录。 11　样品保存   保存可重复检测结果的所有材料，用标签做好标记，如剩余样品、核酸、分离纯化后得到的菌种 等；一般保存期至少1年，以备复验、谈判和仲裁。       GB/T 44610—2024     4