书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２４８６２ — ２０１０ 畜禽体细胞库检测技术规程 犜犲犮犺狀犻犮犪犾狉犲犵狌犾犪狋犻狅狀狅犳犳犪狉犿犪狀犻犿犪犾狊狊狅犿犪狋犻犮犮犲犾犾犫犪狀犽犱犲狋犲犮狋犻狅狀 ２０１０  ０６  ３０ 发布 ２０１１  ０１  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准的附录 Ａ 为资料性附录 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７４ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 。 本标准主要起草人 ： 马月辉 、 关伟军 、 李向臣 、 于太永 、 李晗 、 何晓红 、 刘涛 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２４８６２ — ２０１０ 畜禽体细胞库检测技术规程 １ 　 范围 本标准规定了畜禽体细胞库检测方法 。 本标准适用于猪 、 牛 、 羊 、 马 、 驴 、 鸡 、 鸭 、 鹅等畜禽体外培养细胞鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 　 细胞活率 　 犮犲犾犾犿狅狋犻犾犻狋狔狉犪狋犲 活细胞占总细胞的百分比 。 ３ ． ２ 　 细胞生长曲线 　 犮犲犾犾犵狉狅狑狋犺犮狌狉狏犲 在一代细胞生存期内 ， 依据潜伏期 、 指数增长期 、 停滞期和衰亡期细胞动态变化的数值 ， 以细胞培养 时间为横坐标 、 细胞密度为纵坐标而绘制的细胞生长规律曲线 。 ３ ． ３ 　 核型 　 犽犪狉狔狅狋狔狆犲 体细胞分裂中期整套染色体按照其数目 、 长度 、 着丝点位置 、 随体 、 主缢痕和次缢痕等相对恒定特征 排列起来的图像 。 ３ ． ４ 　 同工酶 　 犻狊狅狕狔犿犲 功能相同结构各异的一类催化酶 。 ３ ． ５ 　 汇合度 　 犮狅狀犳犾狌犲狀犮狔 细胞占其培养表面的比例 。 ４ 　 工作区条件 工作区一般要由准备室 、 缓冲间 、 无菌室 、 细胞保存室组成 。 其中 ， 缓冲间面积应不小于 ３ｍ ２ ， 并设有更衣柜和紫外灯 ， 紫外灯的强度不少于 １．５Ｗ ／ ｍ ３ 。 紫外线灯 管距地面不应超过 ２．５ｍ ， 每次照射时间为 ２０ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 。 无菌室无菌等级的最低标准应达到万级 。 ５ 　 主要仪器 、 设备 电泳仪及电泳槽 、 超净工作台 、 冰箱 、 鼓风干燥箱 、 高压蒸汽消毒器 、 液氮生物容器 、 离心机 、 电子天 平 、 恒温培养箱 、 ＣＯ ２ 培养箱 、 超纯水装置 、 凝胶自动成像分析系统和显微镜等 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２４８６２ — ２０１０ ６ 　 清洗与消毒 ６ ． １ 　 玻璃器皿清洗与消毒 ６ ． １ ． １ 　 浸泡 所需的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡 １２ｈ 。 ６ ． １ ． ２ 　 刷洗 选软毛毛刷 ， 反复洗刷后用清水冲洗 ３ 次 ， 三蒸水冲洗 ３ 次后 ， ６０℃ 下烘干后备用 。 ６ ． １ ． ３ 　 酸浸 酸浸时间为 ２４ｈ 。 ６ ． １ ． ４ 　 冲洗 酸浸后先用自来水反复冲洗 １０ 次以上 ， 最后用重蒸水浸洗 ３ 次 ～ ５ 次 ， 烘干包装 。 ６ ． １ ． ５ 　 消毒 高压灭菌应以 ０．１４ＭＰａ ～ ０．１６ＭＰａ 的压力下持续 １５ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 。 ６ ． １ ． ６ 　 初次玻璃器皿使用 初次使用玻璃器皿需要先经过浸泡和洗刷再置于 ５％ 稀盐酸溶液中浸泡 １２ｈ 以上 ， 其余操作同 ６．１．３ 、 ６．１．４ 和 ６．１．５ 等步骤 。 ６ ． ２ 　 金属器皿清洗与消毒 金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外 ， 其余步骤同 ６．１ 。 ６ ． ３ 　 塑料与橡胶制品清洗与消毒 塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗 ， 之后还需要用 ２％ 的 ＮａＯＨ 溶液浸泡 １２ｈ ， 清水冲洗和烘干后用 １％ 稀盐酸浸泡 ３０ｍｉｎ ， 再用清水和三蒸水分别冲洗 ３ 次 ， 高压灭菌和烘干 后备用 。 高压灭菌以 ０．０７３ＭＰａ 的压力下持续 １０ｍｉｎ 。 ７ 　 主要试剂与溶液配制 主要试剂与溶液配制参见附录 Ａ 。 除另有规定外 ， 试剂为分析纯或生化试剂 。 实验用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 一级用水的要求 ８ 　 体外培养细胞鉴定 ８ ． １ 　 细胞形态检测 ８ ． １ ． １ 　 光学显微镜检测 在倒置相差显微镜下 ， 直接观察和记录培养细胞的形态和生长状况 。 刚贴壁细胞边界清晰 ， 核呈圆 形 ， 核浆比率小 ， 细胞排列整齐 ， 无重叠生长 。 ８ ． １ ． ２ 　 犌犻犲犿狊犪 染色检测 将盖玻片置于细胞培养瓶中 ， 在 ５％ＣＯ ２ 培养箱中 ３７℃ 培养 ， 细胞形成单层后 ， 取出盖玻片 ， 用磷 酸缓冲盐溶液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ ， ＰＢＳ ） 冲洗 ， 放在载玻片上 ， 自然干燥 。 固定液固定 １０ｍｉｎ ， Ｇｉｅｍｓａ 染色 ２ｍｉｎ ， 置于显微镜下观察 。 正常细胞的细胞核被染成紫红色或蓝紫色 ， 细胞质被染成浅 红色 。 　 ８ ． ２ 　 微生物检测 ８ ． ２ ． １ 　 细菌和真菌检测 取 ５ μ Ｌ 细胞悬液 ， 置于 ８ｍＬ 无抗生素培养基中 ， 混匀 ， ３００ 犵 离心 ５ｍｉｎ ， 重复 ２ 次 。 再用 ２ｍＬ 无 抗生素培养基重悬 ， 取 ０．５ｍＬ 接种到胰蛋白胨培养基中 ， 置于 ３７℃ 培养箱以检测细菌 ； 取 ０．５ｍＬ 接 种到麦芽汁培养基中 ， 置于 ２６℃ 培养箱以检测真菌 。 分别培养 ２ 周后 ， 晃动悬液 ， 置于显微镜下观察 ， 无异物则细胞未受细菌和真菌污染 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２４８６２ — ２０１０ ８ ． ２ ． ２ 　 支原体检测 将畜禽细胞接种到无抗生素的培养基中进行细胞单层培养 ， 待盖玻片细胞汇合度达到 ５０％ ～ ６０％ 取出 。 ＰＢＳ 漂洗 ， 固定液浸泡盖玻片 ， 固定 １０ｍｉｎ 后再用 ＰＢＳ 漂洗 。 将 Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ 染液滴加到已 固定的细胞上 ， 染色 ３０ｍｉｎ 。 用 ＰＢＳ 漂洗 ３ 次 ， 每次 ３ｍｉｎ ～ ５ｍｉｎ 。 将 １ 滴含 １％ 封片液的 ＰＢＳ 滴加 到已染色的细胞上 ， 翻转盖玻片盖于载玻片上 。 用 １００ 倍 ～ ４００ 倍荧光显微镜观察 。 细胞核外无蓝色 荧光小点或丝状荧光物表明细胞未受支原体污染 。 ８ ． ２ ． ３ 　 病毒检测 利用酶联免疫吸附试验 、 免疫酶试验 、 免疫荧光试验 、 血凝试验 、 血凝抑制试验 、 免疫酶组织化学 、 放 射免疫测定等方法对畜禽体细胞库进行病毒检测 。 ８ ． ３ 　 细胞活率检测 细胞汇合度达到 ８０％ ～ ８５％ ， 常规法消化 ， 制成 １．０×１０ ６ 个 ／ ｍＬ ～ ３．０×１０ ６ 个 ／ ｍＬ 的细胞悬液 。 取一滴悬液和一滴 ０．４％ 台盼蓝溶液混匀 ， 静置 ２ｍｉｎ 。 用血球计数板计算细胞总数和未着色细胞数 。 ８ ． ４ 　 细胞生长周期鉴定 细胞汇合度达到 ８０％ ～ ８５％ ， 常规法消化 ， 制成悬液 ， 计数 。 分别向培养板 ２１ 个孔接种 １．０×１０ ４ 个 ～ ２．０×１０ ４ 个细胞 ， 置于 ３７℃ 、 ５％ＣＯ ２ 培养箱中培养 。 每隔 ２４ｈ 计数 ３ 个孔内的细胞密度 ， 用血球计 数板计算细胞总数 ， 取 ３ 孔的平均值 ， 连续计数 ７ｄ 。 以培养时间为横坐标 、 细胞密度为纵坐标 ， 绘制细 胞的生长曲线 。 正常生长曲线包括潜伏期 、 指数增长期 、 停滞期和衰亡期四个阶段 。 ８ ． ５ 　 细胞表面抗原检测 细胞接种在盖玻片上 。 用固定液固定 ， －２０℃ 放置 ２０ｍｉｎ 。 弃去固定液 ， 用 ＰＢＳ 漂洗 ３ 次 ， 每次 ３ｍｉｎ ， 加入血清 ， 静置 ２０ｍｉｎ ， 用 ＰＢＳ 洗去血清 。 加入相应的一抗 ， ３７℃ 孵育 ３０ｍｉｎ ， 室温放置 １ｈ ～ ３ｈ 。 用 ＰＢＳ 漂洗后 ， 加入相应的二抗 ， ３７℃ 孵育 ２０ｍｉｎ 。 用 ＰＢＳ 漂洗 ， 封片 ， 镜检 。 细胞表面特异性抗 原与特异性抗体结合 ， 荧光显微镜下进行观察 。 ８ ． ６ 　 细胞核型检测 ８ ． ６ ． １ 　 秋水仙素处理 取对数生长期的细胞 ， 加秋水仙素使其终浓度为 ０．１ μ ｇ ／ ｍＬ ～ ０．４ μ ｇ ／ ｍＬ 。 在 ３７℃ 、 ５％ＣＯ ２ 培 养箱中继续培养 １ｈ ～ ６ｈ ， 使大部分细胞处于分裂中期 。 ８ ． ６ ． ２ 　 分裂相细胞采集 用常规方法消化收集细胞 。 转入 １５ｍＬ 离心管 ， 以 ３００ 犵 离心 ８ｍｉｎ ， 收集细胞 。 ８ ． ６ ． ３ 　 低渗 弃上清液 ， 加入预热至 ３７℃ 、 ０．０７５ｍｏｌ ／ Ｌ （ 或 ０．４％ ） ＫＣｌ 溶液 ２ｍＬ ， 轻轻吹打 ， 继续加至 １０ｍＬ ， ３７℃ 温箱中温育 ３０ｍｉｎ