书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ２４８６３ — ２０１０ 畜禽细胞体外培养与 冷冻保存技术规程 犜犲犮犺狀犻犮犪犾狉犲犵狌犾犪狋犻狅狀狅犳犳犪狉犿犪狀犻犿犪犾狊犮犲犾犾犮狌犾狋狌狉犲犪狀犱犮狉狔狅狆狉犲狊犲狉狏犪狋犻狅狀 ２０１０  ０６  ３０ 发布 ２０１１  ０１  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７４ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 。 本标准主要起草人 ： 关伟军 、 马月辉 、 李向臣 、 李晗 、 闫雷 、 赵倩君 、 宫雪莲 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ２４８６３ — ２０１０ 畜禽细胞体外培养与 冷冻保存技术规程 １ 　 范围 本标准规定了畜禽体细胞保存方法 。 本标准适用于猪 、 牛 、 羊 、 马 、 驴 、 鸡 、 鸭 、 鹅等畜禽细胞体外培养与保存 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 。 凡是注日期的引用文件 ， 其随后所有 的修改单 （ 不包括勘误的内容 ） 或修订版均不适用于本标准 ， 然而 ， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本适用于本标准 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ３ ． １ 体细胞体外培养 　 犻狀狏犻狋狉狅 狊狅犿犪狋犻犮犮犲犾犾犮狌犾狋狌狉犲 将体细胞在模拟体内生存环境的体外条件中进行培养 ， 使细胞生长增殖 ， 并保留其完整结构和功能 特性的方法 。 ３ ． ２ 原代细胞培养 　 狆狉犻犿犪狉狔犮犲犾犾犮狌犾狋狌狉犲 将体细胞在模拟体内生存环境中进行培养 ， 使细胞生长增殖达到可传代状态的培养方法 。 ３ ． ３ 细胞冷冻保存 　 犮犲犾犾犮狉狔狅狆狉犲狊犲狉狏犪狋犻狅狀 将体外培养细胞与冻存液按一定比例混匀后 ， 按设定的降温速率降温 ， 使其于液氮中长期保存的 过程 。 ４ 　 工作区条件 工作区一般要由准备室 、 缓冲间 、 无菌室 、 细胞保存室组成 。 其中 ， 缓冲间面积应不小于 ３ｍ ２ ， 并设有更衣柜和紫外灯 ， 紫外灯的强度为不少于 １．５Ｗ ／ ｍ ３ 。 紫 外线灯管距地面不应超过 ２．５ｍ ， 每次照射时间为 ２０ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 。 无菌室无菌等级的最低标准应达 到万级 。 ５ 　 主要仪器 、 设备 超净工作台 、 冰箱 、 鼓风干燥箱 、 高压蒸汽消毒器 、 液氮生物容器 、 离心机 、 电子天平 、 ＣＯ ２ 培养箱 、 超纯水装置和显微镜等 。 ６ 　 清洗与消毒 ６ ． １ 　 玻璃器皿清洗与消毒 ６ ． １ ． １ 　 浸泡 所需的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡 １２ｈ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ２４８６３ — ２０１０ ６ ． １ ． ２ 　 刷洗 选软毛毛刷 ， 反复洗刷后用清水冲洗 ３ 次 ， 三蒸水冲洗 ３ 次后 ， ６０℃ 下烘干后备用 。 ６ ． １ ． ３ 　 酸浸 酸浸时间为 ２４ｈ 。 ６ ． １ ． ４ 　 冲洗 酸浸后先用自来水反复冲洗 １０ 次以上 ， 最后用超纯水浸洗 ３ 次 ～ ５ 次 ， 烘干包装 。 ６ ． １ ． ５ 　 消毒 高压灭菌应以 ０．１４ＭＰａ ～ ０．１６ＭＰａ 的压力下持续 １５ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 。 ６ ． １ ． ６ 　 初次玻璃器皿使用 初次使用玻璃器皿需要先经过浸泡和洗刷再置于 ５％ 稀盐酸溶液中浸泡 １２ｈ 以上 ， 其余操作同 ６．１．３ 、 ６．１．４ 和 ６．１．５ 等步骤 。 ６ ． ２ 　 金属器皿清洗与消毒 金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外 ， 其余步骤同 ６．１ 。 ６ ． ３ 　 塑料与橡胶制品清洗与消毒 塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗 ， 之后还需要用 ２％ 的 ＮａＯＨ 溶液浸泡 １２ｈ ， 清水冲洗和烘干后用 １％ 稀盐酸浸泡 ３０ｍｉｎ ， 再用清水和三蒸水分别冲洗 ３ 次 ， 高压灭菌和烘干 后备用 。 高压灭菌以 ０．０７３ＭＰａ 的压力下持续 １０ｍｉｎ 。 ７ 　 试剂与培养液 ７ ． １ 　 水 实验用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 一级用水的要求 。 ７ ． ２ 　 平衡盐溶液 生理盐水或磷酸缓冲盐溶液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ ， ＰＢＳ ） 适用于细胞传代前漂洗细胞 。 ７ ． ２ ． １ 　 犘犅犛 称取 ４．００ｇＮａＣｌ 、 ０．１０ｇＫＣｌ 、 １．４５ｇＮａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ 、 ０．１０ｇＫＨ ２ ＰＯ ４ ， 加超纯水定容至 ５００ｍＬ ， 调节 ｐＨ 至 ７．２ ， 高压灭菌 ， 密封后置于 ４℃ 条件下贮存 。 ７ ． ２ ． ２ 　 生理盐水 称取 ４．５０ｇＮａＣｌ ， 加入 ５００ｍＬ 超纯水 ， 高压灭菌 ， 密封后置于 ４℃ 条件下贮存 。 ７ ． ３ 　 血清 １０％ ～ １５％ 的胎牛血清 （ ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ ， ＦＢＳ ） 适合于家畜和家禽细胞的培养 。 ７ ． ４ 　 培养基 ８５％ ～ ９０％ 的高糖最低限量必需培养基 （ ｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ ， ＭＥＭ ）， 适用于家禽细胞的 培养 ； ８５％ ～ ９０％ 的高糖 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ 改良 Ｅａｇｌｅ 培养基 （ ｄｕｌｂｅｃｃｏ ’ ｓｍｏｄｉｆｉｅｄｅａｇｌｅｍｅｄｉｕｍ ， ＤＭＥＭ ）， 适 用于家畜细胞的培养 。 用直径为 ０．２２ μ ｍ 和 ０．４５ μ ｍ 滤器过滤 。 ７ ． ４ ． １ 　 犕犈犕 （ 含 犈犪狉犾犲 ’ 狊 盐 ） 培养基 称取 ９．６０ｇＭＥＭ ， 溶于 １０００ｍＬ 超纯水中 ， 加入 ２．２０ｇＮａＨＣＯ ３ ， 使最终 ｐＨ 为 ７．２ ～ ７．４ ， 用 ０．２２ μ ｍ 的滤器进行过滤 、 分装 。 从每瓶中取 ３ｍＬ ～ ５ｍＬ 用于检菌 ， 其余置于 ４℃ 条件下贮存 。 ７ ． ４ ． ２ 　 高糖 犇犕犈犕 培养基 称取 １３．４０ｇＤＭＥＭ ， 溶于 １０００ｍＬ 超纯水中 ， 加入 ３．７０ｇＮａＨＣＯ ３ ， 使最终 ｐＨ 为 ７．２ ～ ７．４ ， 用 ０．２２ μ ｍ 的滤器进行过滤 、 分装 。 从每瓶中取 ３ｍＬ ～ ５ｍＬ 用于检菌 ， 其余置于 ４℃ 条件下贮存 。 ７ ． ４ ． ３ 　 全培养基 培养基检菌 ３ｄ 后 ， 取出未被污染的 ＭＥＭ 或 ＤＭＥＭ 培养基加入特级 ＦＢＳ ， 使其终浓度为 １０％ 。 用 ０．２２ μ ｍ 的滤器过滤 、 分装 。 从每瓶中取 ３ｍＬ ～ ５ｍＬ 用于检菌 ， 其余置于 ４℃ 条件下贮存 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ２４８６３ — ２０１０ ７ ． ５ 　 消化液 称取 ０．１０ｇ （ 用于家禽 ） 或 ０．２５ｇ （ 用于家畜 ） 胰蛋白酶干粉 ， 溶于 ＰＢＳ 中 ， 调 ｐＨ 至 ７．２ ～ ７．４ ， 定容 至 １００ｍＬ 。 无菌操作台内 ， ０．２２ μ ｍ 滤器过滤除菌 、 分装 ， 密封后 －２０℃ 条件下贮存 。 ７ ． ６ 　 冻存液 ＭＥＭ 或 ＤＭＥＭ 的基础培养基加入终浓度为 １０％ 二甲基亚砜 （ ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ， ＤＭＳＯ ） 和 ２０％ ～ ５０％ＦＢＳ ， ０．２２ μ ｍ 滤膜过滤除菌 ， 密封分装 ， 置于 －２０℃ 条件下贮存 。 ８ 　 体细胞体外培养与保存 ８ ． １ 　 样品采集 ８ ． １ ． １ 　 家畜样品采集 采集家畜耳缘组织 、 脏器 。 耳缘组织采集需先用 ７５％ 的酒精对采样部位进行消毒 ， 剪净耳毛后再 进行消毒采样 ； 采集脏器样品时要用生理盐水冲洗干净 。 根据实验需要选取大小适中的组织样品 ， 放入 ５ｍＬ 备有 ＰＢＳ 或相应基础培养基的离心管中 ， 封口后立即标记样品名称 、 性别 、 年龄 、 采样地点 、 采样 部位 、 个体编号和采样时间等信息 ， 并在记录本上记录 。 ８ ． １ ． ２ 　 家禽样品采集 采集家禽皮肤 、 适当日龄的胚胎组织 ， 其余步骤同 ８．１．１ 。 ８ ． ２ 　 样品运输 样品放入 ４℃ 的采样箱后应迅速运往实验室 。 保存在 ＰＢＳ 中的样品应在 ２４ｈ 内进入原代培养阶 段 。 保存在基础培养基中的样品应在 ４８ｈ 内带回实验室进行原代培养 。 ８ ． ３ 　 原代细胞培养 ８ ． ３ ． １ 　 家畜细胞原代培养 在室温下的超净工作台中用 ＰＢＳ 清洗家畜样品后 ， 将组织样品剪成 １ｍｍ ３ 大小的组织块 ， 均匀涂 于培养瓶底壁 ， 倒置于 ３７℃ 、 ５％ＣＯ ２ 和饱和湿度的培养箱中培养 ， 待组织块微干并黏附在培养瓶底部 后加入适量全培养基浸润组织样品 ， 直至组织样品贴壁牢固时翻瓶加液进行原代培养 。 ８ ． ３ ． ２ 　 家禽细胞原代培养 家禽的胚胎需要去掉脑 、 眼 、 四肢和内脏 ， 其余步骤同 ８．３．１ 。 ８ ． ４ 　 传代培养 ８ ． ４ ． １ 　 家畜细胞传代培养 当家畜细胞汇合达到培养瓶底壁的 ８０％ ～ ８５％ 时 ， 弃去培养基 ， 用生理盐水或 ＰＢＳ 清洗 ３ 次 ， 加入 适量的 ０．２５％ 的胰蛋白酶到