ICS65.020.30 B43 中华人民共和国国家标准 GB/T25165—2010 明 胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 Protocolofidentificationofbovine,caprine,ovineandporcinederived materialsingelatin—RealtimePCRmethod 2010-09-26发布 2011-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:陈颖、吴亚君、袁飞、王晶、徐宝梁、张舒亚、杨海荣、王斌、赵勇胜。 ⅠGB/T25165—2010 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 1 范围 本标准规定了明胶中牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测。 该方法的检出限为0.1%。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB6783 食品添加剂 明胶 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 实时荧光PCR realtimePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.2 Ct值 cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 利用实时荧光PCR技术,根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用裂 解液破碎细胞,酚、三氯甲烷抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行内参照基 因的实时荧光PCR检测,以确定样品DNA的提取效率;通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、 羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增,根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定,实 现对明胶中牛、羊、猪源性成分的定性分析。 5 检测用引物和探针 内参照引物探针序列及牛、羊、猪特异性引物探针序列见表1。 1GB/T25165—2010 表1 检测用引物和探针 名 称 序 列 目的基因 内参照5′端引物 内参照3′端引物 内参照探针5′-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3′ 5′-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3′ 5′-(FAM)-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)-3′真核生物 18SrRNA基因 牛5′端引物 牛3′端引物 牛探针5′-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3′ 5′-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3′ 5′-(FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3′生长激素基因 羊5′端引物 羊3′端引物 羊探针5′-ACACAACTTCTACCACAACCC-3′ 5′-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3′ 5′-(FAM)-ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3′线粒体细胞色 素b基因 猪5′端引物 猪3′端引物 猪探针5′-TTTGTGCATGACTGCGTCAAC-3′ 5′-CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3′ 5′-(FAM)-CACCGTCAAGCAGC-(NFQ)(MGB)-3′朊蛋白基因 6 试剂 苯酚(Tris饱和酚,pH8.0)、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、70%乙醇。 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求。 7 配制溶液 7.1 裂解液 成分包括:2%(质量浓度)CTAB(cetyltrithylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵), 100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane,三羟甲基氨基甲烷),1.4mol/LNaCl, 20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸),用HCl调至pH8.0。 7.2 实时荧光PCR反应混合液 12.5μL反应体系包括:1U~2U(Unit,酶学单位)的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5mmol/L~ 4.0mmol/L的Mg2+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs、0.2mmol/L~ 0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。 8 仪器设备 8.1 实时荧光PCR仪。 8.2 恒温水浴锅。 8.3 离心机:离心力不小于3000g。 8.4 微量移液器:0.5μL~10μL,10μL~100μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。 8.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 8.6 pH计。 8.7 天平:感量0.01g。 9 样品采集 按照GB6783对食用明胶采样,按照GB/T14699.1对饲料明胶采样,将实验样品粉碎,充分混合 均匀后待用。 2GB/T25165—2010 10 检验步骤 10.1 DNA提取 称取样品500mg于50mL离心管中,加入5mL裂解液,室温过夜后置于65℃恒温箱中温育 1h~2h,取出后迅速加入与裂解液等体积的室温酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)(注意:如果样品因 温度下降凝固而无法获得上清,可将样品再次放入65℃恒温箱中使其重新液化),颠倒混匀,室温下 12000g离心10min,转移上清至另一灭菌的离心管中,加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24∶1),颠倒 混匀,室温下12000g离心10min,转移上清至另一灭菌的离心管中,加入0.8倍异丙醇或2倍体积的 预冷无水乙醇混匀,-20℃放置0.5h~1h,4℃下12000g离心10min~15min,弃上清,用70%乙醇 洗涤沉淀一次,4℃下12000g离心10min,弃上清,室温下晾干。加入50μL双蒸水,溶解沉淀, -20℃保存。 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 DNA提取过程中以水代替样品设置提取空白对照,并置于每个提取系列中的最后。 10.2 实时荧光PCR扩增 反应体系的体积为25μL,体系组成见表2。 表2 实时荧光PCR检测反应体系组成 试剂名称 贮备液浓度 加入PCR反应体系的体积/μL 反应混合液 — 12.5 5′端引物 10μmol/L 1 3′端引物 10μmol/L 1 探针 10μmol/L 1 模板 — 5 双蒸水 — 补足至总体积为25 实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变,一般为:50℃2min;95℃10min;95℃15s,60℃ 1min45个循环。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和提取空白对照。用分别含牛、羊、猪成分的样品作阳性对 照,用不含牛、羊、猪成分的样品作阴性对照。 样品设3个重复,对照设2个重复,以Ct平均值作为最终结果。 11 结果判定 11.1 PCR有效性判定 空白对照:无FAM荧光信号,相应Ct值>40.0。 阴性对照:无FAM荧光信号,相应Ct值>40.0。 阳性对照:有FAM荧光信号,且FAM通道出现明显的扩增曲线,Ct值≤36.0。 否则判定为PCR无效。 11.2 DNA提取有效性判定 在同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常的情况下,被检测样品应有FAM荧光信号检出, 且FAM通道出现明显的扩增曲线,Ct值≤40.0。 否则DNA提取无效,应重新提取DNA,直至Ct值≤40.0。 11.3 检测结果判定 在符合11.1和11.2的情况下,使用牛、羊、猪特异性引物和探针对被检样品进行检测:GB/T25165—2010 GB/T25165—2010 如有FAM荧光检出,且Ct值≤36.0,则判定样品含有相应的动物源性成分; 如Ct值>40.0,则判定为不含相应的动物源性成分; 如36.0<Ct≤40.0,则需重复实验,再次扩增后的Ct值仍<40.0,且阴性对照、阳性对照和空白对 照结果正常,则判定该样品含有相应的动物源性成分;再次扩增后结果Ct值≥40.0,且阴性对照、阳性 对照和空白对照结果正常,则判定该样品不含相应的动物源性成分。 12 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。 0102 — 56152T / BG