ICS65.150 B51 中华人民共和国国家标准 GB/T25166—2010 裙 带 菜 Wakame 2010-09-26发布 2011-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。 本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人:王飞久、孙修涛、胡自民、汪文俊、王翔宇、李修良。 ⅠGB/T25166—2010 裙 带 菜 1 范围 本标准规定了裙带菜[Undariapinnatifida(Harvey)Suringar]主要形态构造特征、生活周期与繁 殖、遗传学特征以及检测方法。 本标准适用于裙带菜的种质检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 NY/T5283—2004 无公害食品 裙带菜养殖技术规范 3 名称与分类 3.1 种名 裙带菜[Undariapinnatifida(Harv.)Suringar]。 3.2 分类 褐藻门(Phaeophyta)、褐子纲(Phaeosporeae)、海带目(Laminariales)、翅藻科(Alariaceae)、裙带菜 属(Undaria)。 4 主要形态构造特征 4.1 外部形态特征 4.1.1 孢子体形态 藻体明显分为固着器、柄和叶片三部分。裙带菜孢子体外部形态见图1。 1———固着器; 2———柄; 3———叶片; 4———孢子叶; 5———中肋。 图1 裙带菜孢子体的外部形态 1GB/T25166—2010 4.1.2 固着器 由多次双分枝的圆柱形假根组成,其末端有吸盘。 4.1.3 柄 扁平,其腹背隆起而稍圆,柄的边缘有狭窄的龙骨。藻体接近成熟时,在柄的两侧形成耳状孢子叶, 孢子叶定义见NY/T5283—2004中的3.3。 4.1.4 叶片 褐色具光泽。幼时长盾形,边缘光滑无缺刻,为单叶。成藻为羽状裂片,叶片的中部是由柄部延伸 而来的中肋,中肋扁平隆起直达叶片的顶端。成藻一般长1.0m~2.5m,宽50cm~100cm。 4.2 孢子体内部构造特征 4.2.1 表皮 由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成,呈栅栏状。细胞含粒状色素体。 4.2.2 皮层 外皮层细胞呈柱状,大小不等,排列不整齐。内皮层细胞大小相近,排列较整齐。 4.2.3 髓部 细胞呈丝状或树枝状,排列疏松。 5 生活周期与繁殖 5.1 生活史 明显的孢子体(2n,大型)与配子体(n,微型)不等世代交替型。 5.2 生命周期 裙带菜的生命周期为一年。 5.3 繁殖 5.3.1 性成熟年龄 8个月~12个月。 5.3.2 无性繁殖 孢子体柄部产生孢子叶,孢子叶上产生孢子囊群,孢子囊内形成游孢子。游孢子单细胞,梨形,长 9μm~11μm,宽5μm~6μm,有两条侧生不等长鞭毛,长的14.0μm~16.5μm,伸向前端,短的 5.3μm~7.0μm,伸向后端。 5.3.3 有性繁殖 卵配方式。雄配子体产生精子囊,每个精子囊产生一个梨形精子,精子(n)长4μm~5μm。雌配 子体产生卵囊,每个卵囊产生一个卵(n),卵成熟后排出体外粘着在卵囊口处与精子结合生成合子 (2n)。 6 遗传学特征 6.1 染色体数 孢子体细胞染色体数2n=60。 6.2 DNA序列特征 6.2.1 ITS-1序列:总长度242bp。 1 ccgatcaggaaggggacaccctcctgacactaccgtcgtgcgcgtcggttttgtaaaccccgagaaagaa 71aatcgttacgcgatgttgggcgaggggcgcctcgccgagggttaattccctcgaatcaaagcgcacccca 141cttttcaaccccattaaactctgaatctgaactcaaaaggggggcatgcgcgcgcccgcgcgcgcggctc 211ccccaacctttaacgttgtaaaactttcagcg 6.2.2 ITS-2序列:总长度273bp。 2GB/T25166—2010 1 cccctccctccccctctctttgtggggggggggggggtttcggggcggactatgagtgttccggagcgtc 71cgcgctccgagtgcacccaatctcgtgaacgaagcctctcgcgccctgccgcacagagttgttgacggcg 141ctcgcttcggcggcgactctcgactcaccaaacgtgcgcggggattcgcctgcttcattccggctcatgc 211cttttccccccccccgcccccacgcaagtgagggagggagggaaggagaggccatatccacac 6.2.3 裙带菜不同品系核糖体ITS全序列(ITS-1+ITS-2)变化幅度为0~10个碱基。 7 检测方法 7.1 形态构造特征检验 采用肉眼和显微镜观察相结合的方法。 7.2 染色体检验 7.2.1 标本的制备 压片法。 7.2.2 染色液 2%地衣红溶于70%的乙酸中。 7.2.3 染色方法 固定材料在自来水中浸泡15min~30min后压片。揭开盖片,滴入乙酸地衣红后盖片0.5h,用滤 纸吸出多余的染色液,石蜡封片。 7.3 裙带菜ITS序列的检测 7.3.1 裙带菜配子体基因组DNA的提取 取约1g(湿重)的裙带菜配子体,加少量石英沙和PVP-40,在液氮中研成粉末。将粉末转至50mL 的离心管中,加入15mL裂解缓冲液(10mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,1.0mol/LNaCl, 1.0%CTAB,1%SDS,pH=8.0),在65℃保温1h,期间摇匀几次。用等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊 醇(25∶24∶1,体积比)抽提两次,再将水相转移至一新的50mL离心管中,加入1/10体积RNA酶, 37℃保温1h,再用三氯甲烷∶异戊醇(24∶1,体积比)抽提一次,用2/3体积的异丙醇沉淀回收DNA。 DNA最后溶于100μL的TE(10mmol/LTris-HCl,pH=8.0;1mmol/LEDTA,pH=8.0)中。 7.3.2 ITS特异性扩增 总反应体积为20μL,含10mmol/LTris-HCl,pH=8.3,50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2, Taqpolymerase1U,4种dNTP各2mmol/L,两个引物各4mmol/L~6mmol/L(正向引物P1:5’- CGCGAGTCATCAGCTCGCATT-3’;反向引物P2:5’-AGCTTCACTCGCCGTACTGG-3’),模板 DNA10ng,其余用双蒸馏水补满。 PCR反应参数:96℃预变性5min;96℃,30s;72℃,60s;55℃,30s,37个循环;72℃,保温 5min。 7.3.3 测序 参照DNA测序仪进行测序(参见附录A)。 8 判定规则 被检样品完整并符合本标准第4章要求的为合格样品。如被检样品不完整需增加第5章、第6章 内容进行检验,均符合上述质量要求的为合格样品。GB/T25166—2010 GB/T25166—2010 附 录 A (资料性附录) DNA序列的测序 A.1 测序样品预处理 PCR扩增完毕,将样品置于-20℃条件下。利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。具体操作如下: a) 往PCR产物中加入4倍体积75%异丙醇,室温沉淀30min。在3200r/min下离心30min; b) 去掉上清,加8倍体积75%异丙醇。室温静置10min; c) 在3200r/min下离心10min,去上清; d) 在50℃烘干3min以除去残留的异丙醇,或置于温箱中盖上保鲜膜至无异丙醇; e) 加入适量的无菌去离子水稀释,1000r/min振荡混匀。 A.2 测序 A.2.1 纯化后的PCR产物在ABIPRISM3730测序仪上采用Sanger双脱氧链终止法原理从两端进 行测序。 注:本标准以ABIPRISM3730测序仪为例,不排除采用具有同等工效的其他型号的测序仪。 A.2.2 设立双脱氧测序反应。要求: a) 引物:测序引物即为扩增引物; b) 微量滴定板:为96孔U形微量滴定板; c) 链延伸-链终止反应混合液的配制。 A.2.3 测序凝胶的制备。 A.2.4 准备样品和列表,上样到微量滴定板中进行测序。 A.2.5 电压160V/cm,温度42℃。 A.2.6 根据凝胶的荧光放射自显影,运用计算机读取DNA序列。 A.3 数据处理 利用相关的生物信息学软件读取所测裙带菜ITS序列,并同GenBank中公开的近缘种序列进行比 对,确定裙带菜ITS(包括ITS-1,5.8S和ITS-2)序列的起点和终点。利用软件MEGA计算裙带菜不同 品系ITS序列的变异数目。 0102 — 66152T / BG