ICS65.020.30 B40 中华人民共和国国家标准 GB/T25168—2010 畜 禽cDNA文库构建与保存技术规程 TechnicalregulationoffarmanimalscDNAlibraryconstructionandpreservation 2010-09-26发布 2011-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。 本标准起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人:马月辉、关伟军、陆涛峰、李向臣、佟春玲、余露露、刘鹏。 ⅠGB/T25168—2010 畜禽cDNA文库构建与保存技术规程 1 范围 本标准规定了畜禽cDNA文库构建方法。 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽cDNA文库构建与保存。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 cDNA complementarydeoxyribonucleicacid 以成熟mRNA为模板,在反转录酶的作用下合成的cDNA链。 3.2 cDNA文库 cDNAlibrary 将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总RNA,经过反转录等一系列的生化 反应合成双链cDNA群体后,再插入到适当的载体上,经转化寄主菌株构成特定的cDNA克隆群体。 3.3 寡核苷酸 oligonucleotide 一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称,常用作探针确定DNA或RNA的结构。 3.4 噬菌斑 plaque 被噬菌体感染的细菌所释放的子代噬菌体,会继续感染周围的细胞,致使在琼脂平板上生长的菌苔 中有大量的细胞发生裂解,形成的透明区域。 4 试剂及溶液配制 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682一级用水的要求。 4.1 焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)处理水 在1000mL去离子水中加入1mLDEPC,37℃静置12h,高压灭菌(120℃30min)。 4.2 2mol/LMgSO4 称取246.50gMgSO4·H2O,加400mL双蒸水(doubledistilledH2O,ddH2O)溶解后,定容到 500mL,高压灭菌。 4.3 10mmol/LMgSO4 量取1mL2mol/LMgSO4加ddH2O定容到200mL,高压灭菌,30min。 4.4 1mol/LTris-Cl(pH7.5) 称取121.14gTris,碱溶于800mLddH2O中,调pH至7.5,定容到1L,高压灭菌。 4.5 SM缓冲液 称取5.80gNaCl、2.00gMgSO4·7H2O,量取50mL1mol/LTris-Cl(pH7.5)和5mL2%(质 1GB/T25168—2010 量浓度)明胶,定容到1L,高压灭菌。 4.6 5×一链缓冲液 250mmol/LTris(pH8.3),30mmol/LMgCl2,375mmol/LKCl。 4.7 10×DNA连接酶缓冲液 500mmol/LTris-Cl(pH7.8),100mmol/LMgCl2,100mmol/L二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT),0.5mg/mL牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)。 4.8 LB液体培养基 取10.00gNaCl、10.00g细菌培养用胰蛋白胨和5.00g细菌培养用酵母提取物加1LddH2O溶 解后,高压灭菌。 4.9 LB固体培养基 取10.00gNaCl、10.00g细菌培养用胰蛋白胨、5.00g细菌培养用酵母提取物和20.00g细菌培 养用琼脂加1LddH2O溶解后,高压灭菌。 4.10 LB顶层培养基 将0.70g琼脂糖加入100mLLB液体培养基中,高压灭菌。 4.11 20%麦芽糖 取20.00g麦芽糖溶于100mLddH2O中,过滤除菌。 5 主要仪器、设备 水浴锅、电泳仪、电泳槽、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、PCR扩增仪、超纯水仪、-80℃ 低温冰箱、凝胶自动成像分析系统和低温离心机等。 6 cDNA文库构建 6.1 样品采集 畜禽机体的组织可作为构建cDNA文库的实验材料。将新鲜离体的组织样品迅速投放到液氮中, 或剪切成1mm3大小的组织碎块后放入RNA保存液中。 6.2 总RNA提取 使用TRIzol法提取畜禽组织的总RNA。在不断填充液氮的研钵中将30mg~100mg的组织样 品磨碎,加入1mLTrizol(含有酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉和β-巯基乙醇的单相液),混匀后移至经 DEPC处理水浸泡过的离心管中,静置5min。加入200μL三氯甲烷,混匀,静置2min~3min,4℃ 下,13200g离心15min。移上清至另一离心管中,加入400μL异丙醇,混匀后静置10min,4℃下, 13200g离心10min。弃上清,用DEPC处理水配制的75%乙醇洗涤沉淀2次,室温静置5min~ 10min,晾干后用50μL~100μL的DEPC处理水溶解沉淀后用1%变性琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖 0.3g,DEPC处理水21.6mL,10×Mops3mL,37%甲醛5.4mL,核酸显示剂2μL~3μL)检测RNA 质量,于-80℃冰箱中保存。 6.3 cDNA合成 6.3.1 cDNA第一链合成 采用5′末端RNA转录子转换机制(switchingmechanismat5′endoftheRNAtranscript, SMART)技术合成全长cDNA双链。首先取一PCR管分别加入0.05μg~1.0μg总RNA样品、 1.0μL10μmol/L经过修饰的Oligo(dG)的寡核苷酸和1.0μL10mmol/L经过修饰的Oligo(dT)3′ 引物,添加DEPC处理水使总体积达到5.0μL,混匀,72℃下放置2min,冰浴2min。然后,分别加入 2.0μL5×一链缓冲液、1.0μL20mmol/LDTT、1.0μL10mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribo- nucleosidetriphosphate,dNTP)和1.0μL200U/μLPrimerscripTM反转录酶,混匀,42℃下放置1h, 冰浴2min终止反应后进行下一步操作或-20℃下短期保存。 6.3.2 cDNA第二链的合成 取一PCR管分别加入2.0μL一链cDNA、80μLddH2O、10μL10×Extaq缓冲液、2.0μL 2GB/T25168—2010 2.5mmol/L50×dNTP、2.0μL10μmol/L5′引物、2.0μL10μmol/L经过修饰的Oligo(dT)3′引物 和2.0μL5U/μLExtaq酶,总体积为100μL,混匀,95℃预变性25s后,95℃变性25s,68℃退火延 伸6min,共21个循环。用1.1%琼脂糖对5.0μLPCR产物进行电泳检测,双链cDNA的分布范围在 0.1kb~4.0kb之间。 引物序列为: 5′引物序列5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′ 3′引物序列5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′ (N=A,G,C或T;N-1=A,G或C) 6.4 cDNA的纯化、酶切与分离 6.4.1 cDNA的纯化 取一PCR管分别加入50μL2.0μg~3.0μg双链cDNA、2.0μL20μg/μL蛋白酶K,混匀,45℃ 下放置20min。然后加入50μLddH2O和100μL苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1),混匀,13200g 离心5min。移上清至另一离心管中,加入100μL三氯甲烷-异戊醇(24∶1),混匀,13200g离心5min。 移上清至另一离心管中,分别加入10μL3mol/L乙酸钠(pH4.8)、1.3μL20μg/μL肝糖元、260μL 95%乙醇,13200g离心20min。弃上清,用100μL80%乙醇洗涤沉淀后干燥10min,然后加入79μL ddH2O溶解沉淀。 6.4.2 cDNA的酶切 取一PCR管分别加入79μL双链cDNA、10μL10×SfiⅠ缓冲液、10μL20U/μLSfiⅠ内切酶和 1.0μL100×BSA,总体积为100μL,混匀,50℃下放置2h。加2.0μL1%的二甲苯胺指示剂,混匀。 6.4.3 cDNA的分离 重悬分离柱内容物,自然滴尽柱中溶剂,加入700μL柱缓冲液,滴尽。加入100μL酶切产物,滴 尽。加入100μL柱缓冲液,滴尽。加入600μL柱缓冲液,用16支离心管分别逐滴收集,每管一滴。每 管取3.0μL样品,用1.1%琼脂糖凝胶进行片段大小检测。收集300bp以上的cDNA片段于一离心 管中,分别加入1/10体积3mol/L乙酸钠(pH4.8)、1.3μL20mg/mL肝糖元和2.5体积95%乙醇, 混匀,-20℃下沉淀12h。4℃下,13200g离心20min,弃上清,干燥10min,7.0μLddH2O溶解沉 淀,混匀,-20℃保存。 6.5 c