ICS65.020.30 B40 中华人民共和国国家标准 GB/T25170—2010 畜 禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程 TechnicalregulationoffarmanimalsgenomeBAClibrary constructionandpreservation 2010-09-26发布 2011-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。 本标准起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人:关伟军、马月辉、刘长青、潘春留、刘洪坤、甫亚斌、余露露。 ⅠGB/T25170—2010 畜禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程 1 范围 本标准规定了畜禽基因组BAC文库构建方法。 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽的基因组BAC文库构建与保存。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 基因组文库 genomelibrary 用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到载体上,再转移至适当的宿 主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集。 3.2 细菌人工染色体 bacterialartificialchromosome,BAC 以大肠杆菌致育因子为基础,利用现代重组DNA技术体外人工合成的具有容纳高分子量外源 DNA的特性载体。 3.3 DNA连接 DNAligation 在DNA连接酶催化下,靶DNA片段与载体DNA相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯 键的过程。 3.4 感受态细胞 competentcells 在特定条件下细胞膜通透性发生改变,允许外源DNA进入细胞内的特殊状态下的受体细胞。 3.5 电转化 electrotransformation 在高压脉冲的作用下,将外源DNA导入感受态细胞的过程。 3.6 脉冲场凝胶电泳 pulsefieldgelelectrophoresis,PFGE 利用脉冲场电泳系统电场方向周期性交替变化的功能而分离和鉴定生物大分子的技术。 3.7 重组体 recombinant 两种以上不同来源的DNA片段连接所形成的杂种DNA分子。 1GB/T25170—2010 4 试剂及溶液配制 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水要符合GB/T6682中一级水的要求。 4.1 LB培养冻存缓冲液(luria-bertanimedia) 360mmol/LK2HPO4,13.2mmol/LKH2PO4,1.7mmol/L柠檬酸钠,0.4mmol/LMgSO4, 6.8mmol/L(NH4)2SO4,4.4%甘油,定容至100mL,应用时以冻存缓冲液与LB液体培养基1∶9的 比例配制。 4.2 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷贮存液(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside,X-gal) 用二甲基甲酰胺溶解X-gal,配成20mg/mL贮存液,-20℃避光保存。 4.3 1mol/LTris-Cl 121.10g/LTris碱溶于800mL/L双蒸水(doubledistilledH2O,ddH2O)中,用HCl调pH至 8.0,定容至1000mL,高压灭菌。 4.4 内切酶缓冲液 10mg/mLBSA,10×酶反应缓冲液,1mmol/LDTT,1mmol/L亚精胺。 4.5 SOC培养基 称取20.00g胰化蛋白胨,5.00g酵母提取物,0.50gNaCl,量取2.5mL1mol/LKCl,10mL 2mol/LMgSO4或MgCl2,溶于980mLddH2O,高压灭菌后冷却至60℃以下,加入10mL2mol/L 葡萄糖溶液。 4.6 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷溶液(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG) 称取1.00gIPTG溶于5.0mL双蒸水中,过滤除菌装成1mL/份,贮存于-20℃。 4.7 琼脂糖块储存液 800mLddH2O中加入186.10g乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA),在 磁力搅拌器上搅拌,调pH至8.0后,加ddH2O定容至1000mL,高压灭菌。 4.8 CsCl密度梯度离心纯化液 3.3mL饱和CsCl,加灭菌石蜡油至总体积10mL。 4.9 十二烷基肌氨酸钠缓冲液(N-Dodecanoyl-N-methylglycinesodiumsalt,NDS) 称取186.00gEDTA和1.20gTris-Cl,溶于700mLddH2O中,调pH至8.0,加入NDS调pH 至9.5,用ddH2O定容至1L,过滤灭菌。 4.10 抗凝剂(柠檬酸钠葡萄糖液) 称取0.48g柠檬酸、1.32g柠檬酸钠、1.47g葡萄糖,用ddH2O定容至100mL,高压灭菌。 4.11 氯霉素 乙醇配制,工作浓度为12.5μg/mL,-20℃保存。 4.12 Tris(10mmol/LpH8.0)-EDTA(1.0mmol/LpH8.0)缓冲液,TE 10mmol/LpH8.0Tris-Cl,1.0mmol/LpH8.0EDTA,高压灭菌,室温保存。 4.13 LB液体培养基 称取10.00g细菌培养用胰蛋白胨、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00gNaCl溶于800mL ddH2O中,调pH至7.4,定容至1L,高压灭菌。 4.14 LB固体培养基 称取10.00g细菌培养用胰蛋白胨、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00gNaCl,溶于800mL ddH2O中,调pH至7.4,加入15.00g细胞培养用琼脂,定容至1L,高压灭菌。 4.15 含特定抗生素培养基 按照4.14的方法配制好LB固体培养基,高压灭菌后待其不烫手时,按2mL培养基∶1μL氯霉 素(12.5μg/mL)的比例添加氯霉素,倒20mL培养基于90mm培养板中。待培养基凝固后,将40μL 2GB/T25170—2010 X-gal和7μLIPTG混匀后,均匀涂于培养基表面,超净台里晾干备用。 4.16 碱裂解液Ⅰ 50mmol/L葡萄糖,25mmol/LpH8.0Tris-Cl,10mmol/LpH8.0EDTA,定容至1L,高压灭菌, 4℃保存。 4.17 碱裂解液Ⅱ 0.2mol/LNaOH,1%SDS,现用现配。 4.18 碱裂解液Ⅲ 1.32mol/L乙酸甲,4℃保存。 5 主要仪器、设备 水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、电子天平、-80℃低温冰箱、超纯水仪、低温离心机、凝胶 自动成像分析系统和脉冲电泳仪等。 6 基因组BAC文库构建 6.1 高分子量DNA制备 6.1.1 细胞收集 6.1.1.1 家禽血细胞的收集 采集3.0mL~5.0mL畜禽新鲜血液,立即注入含1mL肝素钠(500U/mL)或柠檬酸钠葡萄糖的 离心管中抗凝。4℃下,4500g离心5min,弃上清,加入等体积预冷的pH7.0磷酸盐缓冲液 (phosphatebufferedsaline,PBS),混匀。上述血细胞收集步骤重复离心3次后,加入1.0mLPBS重悬 细胞。重悬细胞后计数,将血细胞密度稀释到1.0×108个/mL~2.5×108个/mL。 6.1.1.2 家畜血细胞的收集 采集10mL~20mL家畜新鲜血液,加入等体积红细胞裂解液,37℃下放置1h,4℃下,583g离心 5min,其余步骤同6.1.1.1。 6.1.1.3 畜禽其他组织细胞收集 在干冰或液氮存在的条件下,将新鲜的畜禽组织碾成粉末,悬浮在PBS中,振荡混匀,用两层纱布 过滤。其余步骤同6.1.1.1。 6.1.2 细胞裂解 取细胞密度为1.0×108个/mL~2.5×108个/mL的悬液和1%低熔点琼脂糖在45℃下放置5min 后,等体积混匀,隔3min~5min再混匀一次。将100μL混合液置于专用模具中,4℃下放置15min~ 30min形成凝胶块。将凝胶块置于含有0.1mg/mL蛋白酶K和30mL1%NDS缓冲液中,50℃下水浴 3h后更换相同缓冲液,再50℃水浴24h~28h。用30mLTE缓冲液(pH7.6)在30min内洗涤3次(冰 上操作)以去除TE缓冲液,置于1.0mmol/L苯甲基磺酞氟(phenylmethylsulfonylfluoride,PMSF)中, 50℃下水浴30min,中间换液一次。将凝胶块储存于0.5mol/LEDTA(pH8.0)中4℃可保存半年。 6.1.3 基因组DNA酶切与回收 将凝胶块在4℃下用30mLTE缓冲液浸泡3h~4h,中间换液3次~4次。置于1mL的适宜限 制性内切酶缓冲液中,冰浴1h,中间换液1次。分别移至不同酶量(1U~20U)的酶切缓冲液中,冰上 渗透1h后,37℃下酶切10min~30min,用1/10体积0.5mol/LEDTA(pH8.0)终止反应。将不完 全消化的DNA凝胶块在0.5×TBE中,13℃,180V~120V,120°角,脉冲时间60s