ICS67.040 X10 中华人民共和国国家标准 GB/T25221—2010 粮 油检验 粮食中麦角甾醇的测定 正相高效液相色谱法 Inspectionofgrainandoils—Determinationofergosterolingrain— Normalphasehighperformanceliquidchromatography 2010-09-26发布 2011-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家粮食局提出。 本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。 本标准负责起草单位:国家粮食储备局成都粮食储藏科学研究所、辽宁省粮油检验监测所。 本标准主要起草人:何学超、冯永建、姜涛、钟妤、肖学彬、王德谦、熊升伟、乔丽娜。 ⅠGB/T25221—2010 粮油检验 粮食中麦角甾醇的测定 正相高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了正相高效液相色谱法测定粮食中麦角甾醇的术语和定义、原理、试剂与材料、仪器和 设备、扦样、试样制备、操作步骤、结果计算与表示、重复性的要求。 本标准适用于稻谷、小麦、玉米等粮食中麦角甾醇的测定。 本方法检出限为0.05mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB5491 粮食、油料检验 扦样、分样法 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 麦角甾醇 ergosterol 来源于侵染粮食真菌(孢子或菌丝体)产生的游离麦角甾醇和麦角甾醇磷酸酯物质,是真菌细胞的 正常代谢产物,也是真菌细胞膜组成的成分之一。 4 原理 试样经皂化后,用正己烷萃取麦角甾醇,萃取液经脱水、浓缩和硅胶柱分离后,用高效液相色谱仪紫 外检测器在282nm处检测,外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有规定,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中三级水要求,色谱用水符合 GB/T6682中一级水规定的要求。 5.1 正己烷:色谱纯。 5.2 异丙醇:色谱纯。 5.3 正己烷:分析纯,用于提取。 5.4 氢氧化钾。 5.5 50%氢氧化钾溶液:称取10g氢氧化钾(5.4),加10mL水溶解。 5.6 甲醇。 5.7 2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)。 5.8 维生素C(抗坏血酸)。 5.9 焦性没食子酸。 1GB/T25221—2010 5.10 氯化钠。 5.11 饱和氯化钠溶液:称取316g氯化钠(5.10),加881mL水配制。 5.12 无水硫酸钠。 5.13 流动相:正己烷(5.1)和异丙醇(5.2)[V(正己烷)+V(异丙醇)=99+1]。 5.14 麦角甾醇标准品:纯度≥97%。 5.15 麦角甾醇标准储备液:准确称取50mg麦角甾醇标准品(5.14),加0.1g抗氧化剂BHT(5.7), 用异丙醇(5.2)溶解并定容至50mL,于4℃冰箱保存,可保存6个月。 5.16 麦角甾醇标准工作液:根据需要吸取一定量的麦角甾醇标准储备液(5.15),用流动相(5.13)稀释 定容,配制成适当浓度的标准工作液。 5.17 滤膜:0.45μm。 6 仪器和设备 实验室常用仪器设备,以及下列仪器设备: 6.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。 6.2 粉碎磨:机内配0.5mm筛片。 6.3 旋转蒸发器:配150mL梨形瓶。 6.4 恒温水浴:可控温80℃±1℃。 6.5 回流装置:配150mL磨口三角瓶。 6.6 氮吹仪。 7 扦样 样品的扦取和分样按GB5491执行。 8 试样制备 试样用粉碎磨(6.2)粉碎,收集全部粉碎物混匀,装于广口瓶中备用。 9 操作步骤 9.1 提取与净化 称取粉碎试样(第8章)约5g(精确至0.002g),置于回流装置的150mL磨口三角瓶(6.5)中,加入 0.2g抗氧化剂BHT(5.7)、0.6g维生素C(5.8)、2g焦性没食子酸(5.9)和25mL甲醇(5.6),于80℃ 恒温水浴(6.4)回流5min。从冷凝回流管顶部加5mL50%氢氧化钾溶液(5.5),继续回流30min。回 流结束后,从水浴中取下回流装置,取下冷凝回流管,把已通有氮气流的玻璃管(6.6)迅速插入三角瓶通 气约30s,快速塞上瓶塞,于冰水中冷却。再加入55mL饱和氯化钠溶液(5.11)和30mL正己烷 (5.3),塞上瓶塞剧烈振摇2min。转移到150mL分液漏斗中,静置分层,下层转移至另一个分液漏斗 中,用30mL正己烷(5.3)重复提取一次,弃去下层,合并正己烷层。每次用约50mL水洗涤正己烷层, 直至洗涤水呈中性为止。将正己烷层经盛有约5g无水硫酸钠(5.12)的漏斗(漏斗中塞一小团脱脂 棉),滤于浓缩瓶中,再用10mL正己烷(5.3)清洗分液漏斗和漏斗,一并滤入梨形浓缩瓶(6.3)中,用旋 转蒸发器(6.3)浓缩至小体积后,在氮气流(6.6)下蒸发至干。残渣用10.0mL正己烷(5.1)溶解,用 0.45μm滤膜(5.17)过滤,供色谱测定。 9.2 色谱参考条件 色谱柱:Inertsil硅胶柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒度5μm;或性能相当的色谱柱。 流动相流速:2.0mL/min。 检测波长:282nm。 2GB/T25221—2010 9.3 测定 按高效液相色谱仪说明书调整仪器参数和灵敏度,使麦角甾醇峰位与杂质组分峰位完全分离。取 20μL试样溶液(9.1)和麦角甾醇标准工作液(5.16)(控制标液浓度与样液中麦角甾醇的浓度尽量接 近)进样分析,根据峰高或峰面积用单点校正外标法定量。在上述色谱条件下,麦角甾醇标准品和试样 的色谱图参见图A.1和图A.2。 10 结果计算与表示 10.1 结果计算 试样中麦角甾醇含量(X)以毫克每千克(mg/kg)表示,按式(1)计算: X=cS×V×A m×AS……………………………(1) 式中: cS麦角甾醇标准溶液的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); V试样最终定容体积,单位为毫升(mL); AS麦角甾醇标准溶液对应的峰高或峰面积; A试样溶液对应的峰高或峰面积; m样品质量,单位为克(g)。 10.2 结果表示 将符合重复性要求的两个独立测定值的算术平均值作为测定结果(mg/kg),保留三位有效数字。 11 重复性 在同一实验室,由同一操作者使用相同的设备,按相同的测试方法,在短时间内对样品进行两次独 立测定。当测定结果大于3mg/kg时,两个独立测试值的绝对差值应不大于这两个测定值的算术平均 值的10%;当测定结果小于或等于3mg/kg时,获得的两个独立测试结果的绝对差值应不大于这两个 测定值算术平均值的15%。 3GB/T25221—2010 附 录 A (资料性附录) 麦角甾醇色谱图 A.1 麦角甾醇(标准品)色谱图见图A.1。 注:标液浓度1.046μg/mL,出峰时间11.59min;抗氧化剂BHT出峰时间3.19min。 图A.1 麦角甾醇标准品色谱图 A.2 小麦、稻谷、玉米中麦角甾醇色谱图分别见图A.2、图A.3、图A.4。 图A.2 小麦麦角甾醇色谱图 4GB/T25221—2010 图A.3 稻谷麦角甾醇色谱图 图A.4 玉米麦角甾醇色谱图 5GB/T25221—2010 参 考 文 献 [1] SchwadorfK,MüllerHM.Determinationofergosterolincereals,mixedfeedcomponents, andmixedfeedsbyliquidchromatography.J.Assoc.ofAnal.Chem.,1989,72:457-462. [2] SioF,LarattaB,GiovaneA,etal.Analysisoffreeandesterrifiedergosterolintomato products.J.Agric.FoodChem.,2000,48:780-784. 6GB/T25221—2010