ICS07.080 CCSA40 中华人民共和国国家标准 GB/T33682—2025 代替GB/T33682—2017 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 鉴别微生物方法通则 Generalmicrooganismidentificationmethodwithmatrix-assistedlaser desorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry 2025-05-30发布 2025-09-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T33682—2017《基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》,与 GB/T33682—2017相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———增加了菌种不同前处理方法要求(见8.2); ———增加了仪器设置条件要求(见8.4.1); ———增加了“质量控制”的要求(见8.6); ———更改了“结果判读”的判读标准(见8.8,2017年版的8.7); ———更改了“结果报告”的报告要求(第9章,2017年版的第9章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本文件起草单位:河北省食品检验研究院、中国测试技术研究院、黑龙江省知识产权保护中心、清华 大学、广州华鑫检测技术有限公司、苏州世谱检测技术有限公司、河南大学、北京食品科学研究院、南京 财经大学、河北医科大学、北京工商大学、浙江工业大学、中国检验检疫科学研究院、兰州百源基因技术 有限公司。 本文件主要起草人:张岩、周巍、王怡、周李华、彭丽萍、李永波、康文艺、孙勇、吕品、文迪、范素芳、 汤晓智、冯潇、张雅伦、王彦波、周绪霞、张瑞、车团结、陈晨、廖华勇、代丹、王慧、刘帅、任晓燕、牛相涛、 邹燕、郑晓玲。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2017年首次发布为GB/T33682—2017; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T33682—2025 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 鉴别微生物方法通则 1 范围 本文件规定了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴别微生物的方法通则。 本文件适用于微生物种属的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微生物蛋白质指纹图谱 microbialproteinfingerprinting 将分离纯化后的单个菌落,直接涂于靶板上,待干燥后加上基质混合,微生物可溶性蛋白与基质形 成共结晶体后通过真空飞行时间管获取不同质电荷比的蛋白分子质谱指纹图谱。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BTS:细菌检测标准样品。 MALDI-TOFMS:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。 MALDI-TOF-TOFMS:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱串联质谱。 MSP:主谱图。 5 原理 常见微生物都由区别于其他种类的特殊蛋白质组成,因而拥有独特的蛋白质指纹图谱,这是由物种 的遗传特性所决定的,受外界环境条件等影响较小。 样品(来自痰、血、体液、拭子等临床样本及食品、化妆品、药品及环境等)经适当的处理,在固体培养 基上培养、分离出单个菌落后,直接点样至靶板并将其放入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱内,经 离子化按照质量/电荷(m/z)比值大小分离,将采集的数据与微生物指纹图谱库对照鉴定。 1GB/T33682—2025 6 试剂与标准样品/标准物质 除非有特殊说明,仅使用色谱纯试剂。 6.1 甲酸(HCOOH)。 6.2 乙腈(CH3CN)。 6.3 乙醇(CH3CH2OH)。 6.4 三氟乙酸(CF3COOH)。 6.5 磷酸盐缓冲液:见附录A中的A.1。 6.6 α-氰基-4羟基肉桂酸(C10H7NO3),光谱纯。 6.7 2,5-二羟基苯甲酸(C7H6O4),光谱纯。 6.8 血琼脂培养基:见A.2。 6.9 沙氏琼脂培养基:见A.3。 6.10 标准菌株:ATCC8739大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)或其等效菌株。 6.11 一级水(符合GB/T6682的规定)。 7 仪器与设备 7.1 MALDI-TOFMS质谱仪或MALDI-TOF-TOFMS质谱仪。 7.2 二级生物安全柜。 7.3 离心机:12000g。 7.4 恒温培养箱。 7.5 旋涡混合器。 7.6 显微镜。 7.7 微量移液器及枪头:10μL、20μL、100μL、1000μL。 7.8 一次性或重复使用靶板。 7.9 接种环。 8 试验步骤 8.1 微生物培养 细菌划线接种血琼脂培养基,36℃±1℃培养24h±2h;酵母样真菌划线接种沙氏琼脂培养 基,25℃±1℃培养2d~3d;其他类型微生物,如丝状真菌、分枝杆菌和诺卡氏菌等,可参照目标菌相 关检验标准中规定的培养基和培养方法执行。选取单个菌落以待上机测试。 8.2 样品上机(点靶) 8.2.1 细菌 直接涂抹法:鉴定细菌时,使用合适的工具(如接种环)在单个菌落上挑取微量菌泥,点在样品靶板 孔中,涂抹均匀待室温干燥后用微量移液器加入1μL基质溶液,在室温下自然晾干(或使用配套辅助设 备烘干)。 2GB/T33682—2025 8.2.2 酵母样真菌 原位甲酸提取法:鉴定酵母时,直接涂抹后用70%甲酸溶液处理,再用微量移液器吸取1μL基质 溶液,与样品混合,在室温下自然晾干(或使用配套辅助设备烘干),形成结晶。或先用微量移液器移取 70%甲酸溶液处理后(破坏细胞壁,使蛋白溶出),再用微量移液器加入1μL基质溶液,在室温下自然晾 干(或使用配套辅助设备烘干)。 8.2.3 丝状真菌 乙醇灭活+甲酸、乙腈提取法:将无菌棉拭子在去离子水中沾湿后,从培养基上刮取1cm2~2cm2 丝状真菌菌落,转移至装有300μL超纯水的2mL离心管中。向离心管中加入900μL乙醇,用旋涡混 合器混匀3s~5s。混合后用离心机在10000g离心2min后去除上清液,在室温下自然晾干(或使用 配套辅助设备烘干)。加入40μL70%甲酸旋涡混合3s~5s,之后再加入40μL乙腈旋涡混合3s~5 s,用离心机在10000g离心2min后,用微量移液器吸取1μL样品加在样品靶板孔中,待室温干燥后 再用微量移液器加入1μL基质溶液,在室温下自然晾干(或使用配套辅助设备烘干)。 8.2.4 分枝杆菌/诺卡菌 硅珠破壁+甲酸、乙腈提取法:将无菌棉拭子在去离子水中沾湿后,从培养基上刮取1cm2~2cm2 分枝杆菌/诺卡菌菌落,转移至装有300μL超纯水的2mL离心管中。向离心管中加入900μL乙醇并 辅以0.5mm直径的硅珠振荡破壁。用离心机在10000g离心2min后去除上清液,在室温下自然晾干 (或使用配套辅助设备烘干)。加入40μL70%甲酸旋涡混合3s~5s,之后再加入40μL乙腈旋涡混合 3s~5s,用离心机在10000g离心2min后,用微量移液器吸取1μL样品加在样品靶板孔中,待室温 干燥后再用微量移液器加入1μL基质溶液,在室温下自然晾干(或使用配套辅助设备烘干)。 8.2.5 分枝杆菌(液体培养) 液体培养直接提取法:液体培养报阳后,继续培养24h~72h,经离心后去除上清液,对沉淀物使用 硅珠破壁+甲酸、乙腈提取法(8.2.4)进行提取。 8.3 生物防护 所有标本、微生物培养物以及接种后的实验材料均应在符合GB19489规定的相应生物安全等级 的实验室条件下进行操作,并适当处置。 8.4 仪器条件 8.4.1 仪器 MALDI-TOFMS:线性操作模式,正离子模式;检测范围:2000Da~20000Da,激光点击数:每图 谱大于40次(6次激光累积);激光频率:大于60.0Hz;离子源加速电压:20kV。 MALDI-TOF-TOFMS:固态UV激光光源,检测范围为0Da~3000Da,激光点击数:每图谱大于 100次(100次激光累积),最大激光重复频率2000Hz。 8.4.2 激光能量 每激光束能量100μJ,激光能量可从0%~100%范围调节。 8.4.3 微生物蛋白指纹图谱数据库 包含目标微生物的商品化数据库或自建库,自建库的操作步骤见B.1。 3GB/T33682—2025 8.5 质控菌株校准 将大肠埃希氏菌(或其等效菌株)转种至血琼脂培养基上36℃±1℃培养24h±2h。每次检测 样品前宜使用大肠埃希氏菌(或其等效菌株)的11个特征峰校准飞行时间质谱,见图B.1。 每次开机检测前,参考厂商的操作说明对标准样品进行分析,通常选用的标准样品包括标准菌株或 细菌检测标准样品(BTS)。 8.6 质量控制 应采用国家标准样品进行质量控制,如无对应的国家标准样品可采用相应种属的标准菌株进行质 量控制。质量控制结果应符合国家标准样品或标准菌株特性,每批可疑样品中选用相应的质量控制菌 株一起上机测试。 8.7 鉴定 将样品靶板放入仪器内,设定合适的激光能量、质谱扫描范围等参数,开始质谱数据采集。数据采 集完成后,将经过处理的质谱数据自动/手动