书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３４７２０ — ２０１７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F 犇犻犪犵狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犮狅狀狋犪犵犻狅狌狊犮犪狆狉犻狀犲狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪 ２０１７  １１  ０１ /G30 /G31 ２０１８  ０５  ０１ /G32 /G33 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G30 /G31书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准参考世界动物卫生组织 ＯＩＥ 《 陆生动物疫病诊断试验和疫苗手册 》（ ２０１５ 年版 ） 第 ２．７．６ 章山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术部分规定 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院兰州兽医研究所 。 本标准主要起草人 ： 逯忠新 、 储岳峰 、 高鹏程 、 赵萍 、 贺英 、 陈胜利 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３４７２０ — ２０１７ 引 　　 言 　　 本文件的发布机构提请注意 ， 声明符合本文件时 ， 可能涉及附录 Ｄ 与 《 一种用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂盒 》 相关的专利的使用 。 本文件的发布机构对于该专利的真实性 、 有效性和范围无任何立场 。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证 ， 他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下 ， 就专利授权许可进行谈判 。 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 。 相关信息可以通过以下联系方式获得 ： 专利持有人姓名 ： 逯忠新 、 储岳峰 、 赵萍 、 高鹏程 、 贺英 、 郭晗地址 ： 甘肃省兰州市城关区徐家坪 １ 号请注意除上述专利外 ， 本文件的某些内容仍可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ３４７２０ — ２０１７ 山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术 １ 　 范围 本标准规定了山羊接触传染性胸膜肺炎临床症状 、 病理变化 、 流行病学临床诊断及病原分离鉴定 、 ＰＣＲ 、 间接血凝试验等实验室诊断的技术要求 。 本标准适用于山羊接触传染性胸膜肺炎的诊断 。 ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ｂｐ ： 碱基对 （ ＢａｓｅＰａｉｒ ） ＣＣＰＰ ： 山羊接触传染性胸膜肺炎 （ ＣｏｎｔａｇｉｏｕｓＣａｐｒｉｎｅＰｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ ） ＣＣＵ ： 颜色变化单位 （ ＣｏｌｏｒＣｈａｎｇｅＵｎｉｔ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ｄＮＴＰｓ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅＴｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ） ＩＨＡ ： 间接血凝试验 （ ＩｎｄｉｒｅｃｔＨｅａｍａｇｇｌｕｔｉｏｎＡｓｓａｙ ） 犕犮犮狆 ： 山羊支原体山羊肺炎亚种 （ 犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪犮犪狆狉犻犮狅犾狌犿 ｓｕｂｓｐ． 犮犪狆狉犻狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲 ） ＭＴＡ ： 改良 Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔ 氏琼脂培养基 （ ＭｏｄｉｆｉｅｄＴｈｉａｕｃｏｕｒｔ ’ ｓＡｇａｒ ） ＭＴＢ ： 改良 Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔ 氏肉汤培养基 （ ＭｏｄｉｆｉｅｄＴｈｉａｕｃｏｕｒｔ ’ ｓＢｒｏｔｈ ） ＰＢＳ ： 磷酸盐缓冲液 （ ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） ＰＰＬＯ ： 类胸膜肺炎微生物 （ ＰｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｌｉｋｅＯｒｇａｎｉｓｍ ） ＴＡＥ ： 核酸电泳缓冲液 （ ＴｒｉｓＡｃｅｔｉｃａｃｉｄＥＤＴＡ ） 犜犪狇 酶 ： 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ 犜犪狇 ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ） ３ 　 临床诊断 ３ ． １ 　 临床症状 ３ ． １ ． １ 　 急性病例 ： 潜伏期 ２ｄ ～ ２８ｄ 。 初期病羊咳嗽 、 不愿走动并出现发热 （ 达 ４１℃ 或以上 ）， 逐渐出现呼吸急促 （ 有时会发出呼噜声 ） 和剧烈咳嗽等症状 ， 发病后期 ， 病羊四肢外展站立且脖颈伸直 ， 口鼻持续流涎 ， 鼻孔逐渐被脓性分泌物堵住 ， 舌头伸出 ， 死亡 。 ３ ． １ ． ２ 　 慢性病例 ： 病程持续时间长 ， 可达数月 ， 一般仅表现消瘦 、 厌食 、 间歇性咳嗽 、 流涕和发热 （ 持续 ３ｄ ～ １０ｄ ） 等 。 ３ ． ２ 　 病理变化 ３ ． ２ ． １ 　 病变仅局限于胸腔 。 ３ ． ２ ． ２ 　 急性病例 ： 肺组织肝变 （ 多数为单侧非对称性肝变 ， 呈葡萄酒颜色 ）、 肺和胸膜粘连 、 胸腔积有纤维性渗出液等 ， 严重时胸腔渗出物暴露于空气中在肺表面形成一层胶状包膜 。 ３ ． ２ ． ３ 　 慢性病例 ： 肺组织局部出现小面积肝变或坏死灶 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３４７２０ — ２０１７ ３ ． ３ 　 流行病学 ３ ． ３ ． １ 　 本病主要依靠飞沫和接触传播 ， 一年四季均有流行 ， 冬春季节多发 。 ３ ． ３ ． ２ 　 所有年龄 、 性别的山羊对本病均易感 。 耐过病羊在相当长时间内可通过呼吸道向外界排毒 ， 成 为传染源 。 ３ ． ３ ． ３ 　 环境和应激因素如营养缺乏 、 气候骤变 、 羊群密集 、 长途调运 、 寒冷潮湿等情况下易诱发本病 。 ３ ． ３ ． ４ 　 非疫区首次发病羊多呈急性经过 ， 死亡率高 ； 疫区羊发病多呈慢性经过 ， 死亡率低 。 ３ ． ４ 　 临床诊断结果判定 符合 ３．１ 、 ３．２ 、 ３．３ 的临床症状 、 病理变化及流行病学特征的发病羊 ， 可判定为疑似山羊接触传染性 胸膜肺炎 。 ４ 　 实验室诊断 ４ ． １ 　 样品的采集与运输 ４ ． １ ． １ 　 样品的采集 ４ ． １ ． １ ． １ 　 将棉拭子伸入待检山羊鼻腔内采集分泌物 ； 无菌采集肺脏病变部位 、 特别是病变部位和非病变 部位交界处的肺组织和纵隔淋巴结 ； 若有胸水则无菌采集后 ， 分别放入灭菌容器保存 。 ４ ． １ ． １ ． ２ 　 无菌采集羊颈静脉血 ， 常规方法分离血清 。 ４ ． １ ． ２ 　 样品运输与保存 ４ ． １ ． ２ ． １ 　 样品采集后 ， 置冰上冷藏送至实验室检测 。 ４ ． １ ． ２ ． ２ 　 血清储存应置于 －２０℃ 冰箱 ， 检测前应在 ５６℃ 水浴灭活 ３０ｍｉｎ 。 ４ ． １ ． ２ ． ３ 　 棉拭子 、 组织样品和胸水储存应置于 －７０℃ 冰箱 。 ４ ． ２ 　 器械与设备 ４ ． ２ ． １ 　 普通培养箱 ： ３７℃ 。 ４ ． ２ ． ２ 　 组织匀浆设备 。 ４ ． ２ ． ３ 　 低温台式高速离心机 。 ４ ． ２ ． ４ 　 生物安全柜或超净工作台 。 ４ ． ２ ． ５ 　 普通光学显微镜 。 ４ ． ２ ． ６ 　 ＰＣＲ 扩增仪 。 ４ ． ２ ． ７ 　 电泳仪和电泳槽 。 ４ ． ２ ． ８ 　 凝胶成像系统或紫外检测仪 。 ４ ． ２ ． ９ 　 涡旋振荡器 。 ４ ． ２ ． １０ 　 微型震荡器 。 ４ ． ２ ． １１ 　 水浴箱 。 ４ ． ２ ． １２ 　 ９６ 孔 Ｖ 型 （ １１０° ） 聚苯乙烯血凝反应板 。 ４ ． ２ ． １３ 　 移液器 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３４７２０ — ２０１７ ４ ． ３ 　 病原分离与鉴定 ４ ． ３ ． １ 　 试剂与材料 除另有规定外 ， 生物试剂为生化试剂级 、 化学试剂为分析纯 。 ＭＴＢ 培养基 （ 见 Ａ．１ ）、 ＭＴＡ 培养基 （ 见 Ａ．２ ）。 ４ ． ３ ． ２ 　 样品处理 ４ ． ３ ． ２ ． １ 　 鼻拭子置于 １ｍＬＭＴＢ 培养基中 ， 充分捻动 ， 挤干后弃去拭子 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清 ０．５ｍＬ ， 作为接种材料 。 ４ ． ３ ． ２ ． ２ 　 组织样品用剪刀剪碎 ， 每 ０．１ｇ 加 ＭＴＢ 培养基 ０．９ｍＬ ， 研磨匀浆 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清 ０．５ｍＬ ， 作为接种材料 。 ４ ． ３ ． ２ ． ３ 　 胸水用 ＭＴＢ 培养基 １∶１ 稀释后 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清 ０．５ｍＬ ， 作为接种材料 。 ４ ． ３ ． ３ 　 样品接种 取样品上清液接种 ４．５ｍＬＭＴＢ 培养基 ， 标记为 １０ －１ 管 ， 并作 １０ 倍系列稀释至 １０ －３ 管 。 同时 ， 从各个稀释度 （ １０ －１ ～ １０ －３ ） 试管中取 ０．２ｍＬ 接种 ＭＴＡ 培养基 （ 培养皿 ）， 用封口膜封口 。 将 ３ 个稀释度的 ＭＴＢ 试管和 ＭＴＡ 平皿置 ３７℃ 培养 。 ４ ． ３ ． ４ 　 观察结果及克隆纯化 ４ ． ３ ． ４ ． １