书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３４７２８ — ２０１７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 犘犆犚 /G26 /G27 /G28 /G29 犘犆犚犳狅狉 犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪犪犵犪犾犪犮狋犻犪犲 ２０１７  １１  ０１ /G2A /G2B ２０１８  ０５  ０１ /G2C /G2D /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G2A /G2B书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国农业科学院兰州兽医研究所 。 本标准起草人 ： 储岳峰 、 赵萍 、 高鹏程 、 陈胜利 、 贺英 、 逯忠新 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３４７２８ — ２０１７ 无乳支原体 犘犆犚 检测方法 １ 　 范围 本标准规定了无乳支原体 ＰＣＲ 检测方法的技术要求 。 本标准适用于检测羊 （ 山羊和绵羊 ） 临床样品和分离培养物中无乳支原体的核酸 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＣＡ ： 接触传染性无乳症 （ ＣｏｎｔａｇｉｏｕｓＡｇａｌａｃｔｉａ ） 犕犪犵犪 ： 无乳支原体 （ 犕狔犮狅狆犾犪狊犿犪犪犵犪犾犪犮狋犻犪犲 ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） ＴＡＥ ： 核酸电泳缓冲液 （ ＴｒｉｓＡｃｅｔｉｃａｃｉｄＥＤＴＡ ） ＣＣＵ ： 颜色变化单位 （ Ｃｏｌｏｒｃｈａｎｇｅｕｎｉｔ ） 犜犪狇 酶 ： 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ 犜犪狇 ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ｄＮＴＰｓ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅＴｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ） ｂｐ ： 碱基对 （ ＢａｓｅＰａｉｒ ） ４ 　 仪器器材 ４ ． １ 　 仪器 高速冷冻离心机 、 ＰＣＲ 扩增仪 、 核酸电泳仪 、 水平电泳槽 、 恒温水浴锅 、 普通冰箱 、 低温冰箱 （ －７０℃ ）、 凝胶成像系统 、 高压灭菌锅 、 组织匀浆设备 。 ４ ． ２ 　 器材 微量加样器 （ ０．５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 ２ μ Ｌ ～ ２０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ）、 ０．２２ μ ｍ 无菌滤器 、 无菌棉拭子 、 灭菌采样容器 。 ５ 　 试剂 ５ ． １ 　 ２×ＰＣＲ 反应预混合液 （ 含 犜犪狇 酶 、 ｄＮＴＰｓ 和上样缓冲液 ）。 ５ ． ２ 　 ＤＬ２０００ＤＮＡ 分子质量标准 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３４７２８ — ２０１７ ５ ． ３ 　 电泳缓冲液 （ ＴＡＥ ）、 １％ 琼脂糖 、 ０．８５％ 生理盐水 、 犕犪犵犪 培养基 ， 配制方法见附录 Ａ 。 ５ ． ４ 　 ６×ＰＣＲ 上样缓冲液 。 ５ ． ５ 　 阴 、 阳性对照 （ 制备方法见附录 Ｂ ）。 ５ ． ６ 　 商业合成的引物 ， 上游引物 （ ＭＡＧＡＵＶＲＣ１Ｌ ） 的序列为 ： ５ ’ ＣＴＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＣ３ ’； 下游引物 （ ＭＡＧＡＵＶＲＣ１Ｒ ） 的序列为 ： ５ ’ ＣＴＴＣＡＡＣＴＧＡＴＧＣＡＴＣＡＴＡＡ３ ’。 合成的引物用符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的分析实验室用水 （ 蒸馏水 ） 配成 ２０ｐｍｏｌ ／ μ Ｌ 。 ６ 　 操作程序 ６ ． １ 　 样品采集 ６ ． １ ． １ 　 奶样 乳腺炎病羊无菌采集的新鲜奶样置于灭菌容器中 （ 不少于 １．５ｍＬ ）。 ６ ． １ ． ２ 　 关节液 关节炎病羊无菌采集的关节液置于灭菌容器中 （ 不少于 １．５ｍＬ ）。 ６ ． １ ． ３ 　 眼拭子 角膜结膜炎病羊用灭菌棉拭子在的眼结膜表面和眼角轻轻擦拭后置于灭菌容器中 。 ６ ． １ ． ４ 　 组织 刚扑杀或死亡时间不超过 ２４ｈ 病畜采集乳房病变部位组织及其附近淋巴结 ， 置于灭菌容器中 。 ６ ． ２ 　 样品的运输与储存 ６ ． ２ ． １ 　 以上样品采集后应立即置于带有冰袋的运输箱中 ， 送至实验室检测 。 样品被运到实验室时 ， 附带的冰袋应没有完全融化 。 ６ ． ２ ． ２ 　 如样品不能被及时送到实验室 ， 应置于 －２０℃ 冰箱中保存 ， 保存期应不超过 １ 个月 ； 如需长期保存样品 ， 应置于 －７０℃ 冰箱 。 ６ ． ３ 　 样品的处理 ６ ． ３ ． １ 　 奶样的处理 与生理盐水等体积混匀后 ， ４℃ 、 １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃上清 ， 收集沉淀 。 ６ ． ３ ． ２ 　 关节液的处理 与生理盐水等体积混匀后 ， ４℃ 、 １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃上清 ， 收集沉淀 。 ６ ． ３ ． ３ 　 眼拭子的处理 浸入 １ｍＬ 生理盐水中 ３０ｍｉｎ ， 充分捻动 ， 挤干后弃去拭子 ， 将浸出液在 ４℃ 、 １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃上清 ， 收集沉淀 。 ６ ． ３ ． ４ 　 组织样品的处理 剪成小块 ， 按 １ｇ 加入 ０．９ｍＬ 生理盐水研磨后 ， 在 ４℃ 、 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃沉淀 。 取上清在 ４℃ 、 １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 后 ， 弃上清 ， 收集沉淀 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３４７２８ — ２０１７ ６ ． ３ ． ５ 　 培养物样品的处理 分离的疑似 犕犪犵犪 培养物取 １ｍＬ ， ４℃ 、 １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 后 ， 弃上清 ， 收集沉淀 。 ６ ． ３ ． ６ 　 阴 、 阳性对照的处理 阴 、 阳性对照样品各 １ｍＬ ， ４℃ 、 １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 后 ， 弃上清 ， 收集沉淀 。 ６ ． ４ 　 样品 犇犖犃 的提取 用适宜的基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 ， 按照说明书提取样品基因组 ＤＮＡ ， 提取物最终体积为 ５０ μ Ｌ 。 ＤＮＡ 提取操作应在通风柜中进行 。 ６ ． ５ 　 犘犆犚 反应 ６ ． ５ ． １ 　 反应体系 按下列方法配制 ５０ μ Ｌ 反应体系 ： ＤＮＡ 模板 　　　　　　 ５ μ Ｌ２×ＰＣＲ 反应液 ２５ μ Ｌ 上游引物 １ μ Ｌ 下游引物 １ μ Ｌ 灭菌去离子水 １８ μ Ｌ 每次反应设阴 、 阳性样品对照和空白对照 ， 阴性样品对照用 犕犪犵犪 培养基提取的 ＤＮＡ 作为模板 ， 阳性对照用 犕犪犵犪 灭活培养物提取的 ＤＮＡ 作为模板 ， 空白对照用灭菌去离子水作为模板 。 ６ ． ５ ． ２ 　 反应扩增程序 加样后 ， 置于 ＰＣＲ 扩增仪进行反应 ， 反应条件如下 ： ９５℃５ｍｉｎ 进行 ＰＣＲ 预变性 ， 然后进行 ３５ 个循环的扩增 （ ９４℃３０ｓ ， ５０℃３０ｓ ， ７２℃６０ｓ ）， 最后 ７２℃ 延伸 １０ｍｉｎ ， ４℃ 保存 。 ６ ． ６ 　 电泳观察 取 ＰＣＲ 产物各 ５ μ Ｌ （ 包括被检样品 ， 阴 、 阳性对照样品 、 阳性质粒对照和空白对照 ）， 分别和 １ μ Ｌ６×ＰＣＲ 上样缓冲液混合均匀后 ， 连同 ＤＮＡ 分子质量标准在 １％ 琼脂糖凝胶中进行电泳 ， 凝胶成像系统中观察结果 （ 参见附录 Ｃ ）。 ７ 　 结果判定 ７ ． １ 　 实验成立的条件 电泳观察显示 ， 阳性对照有 １６２４ｂｐ 的特异性扩增条带 ， 阴性和空白对照没有相应条带 ， 则试验成立 。 ７ ． ２ 　 实验结果判定 符合 ７．１ 的条件 ， 样品出现 １６２４ｂｐ 的特异性扩增条带判为 ＰＣＲ 结果阳性 ， 表述为检出无乳支原体核酸 。 样品无特异性的阳性扩增条带判为 ＰＣＲ 结果阴性 ， 表述为未检出无乳支原体核酸 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３４７２８ — ２０１７ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 溶液的配制 犃 ． １ 　 犜犃犈 电泳缓冲液 （ 狆犎 ８ ． ０ ） 的配制 Ｔｒｉｓ 碱 　　　　　　　　　　　　　　 ２４２ｇＥＤＴＡ ３７．２ｇ 冰乙酸 ５７．１ｍＬ 加去离子水至 １０００ｍＬ ， 使用前用去离子水 ５０ 倍稀释 。 犃 ． ２ 　 １ ％ 的琼脂糖电泳凝胶板制备 将琼脂糖 １ｇ 加入 １００ｍＬ１×ＴＡＥ 电泳缓冲液中 ， 加热融化 ， 温度降至 ６０℃ 左右时加入适宜的核酸染料 ， 均匀铺板 ， 厚度为 ３ｍｍ ～ ５ｍｍ 。 犃 ． ３ 　 ０ ． ８５ ％ 生理盐水的配制 将 ８．５ｇ 氯化钠溶入 １０００ｍＬ 去