ICS07.100.30 CCSC53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4544.2—2022 商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法二 Commercial kit method—Aerobic count—Test methodⅡ 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是SN/T 4544《商品化试剂盒检测方法 菌落总数》的第2部分。SN/T 4544已经发布了 以下部分: ———商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法一; ———商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法二。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关。 本文件主要起草人:郑晶、林杰、郭菁、肖颖、陈彬、董健、柯璐、徐珊、张温玲、戴晓丽。 ⅠSN/T4544.2—2022 以正式出版文本为准商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法二 1 范围 本文件规定了食品中两种3M菌落总数测试片(3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate和3M Petri- filmTM Rapid Aerobic Count Plate)的检测方法。 本文件适用于食品中菌落总数的测定。该方法不适于米粉等10倍稀释后流动性不强的食品;不适 于10倍稀释后色度较深的食品。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27405 实验室质量控制规范 食品微生物检测 SN/T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法 SN/T 3266 食品微生物检验方法确认技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染,应由具备资格的工作人员检测菌落总数。所有培养物和 废弃物应按照GB 19489和GB/T 27405中的有关规定执行。 5 技术概要 菌落总数测试片(3M PetrifilmTM Aerobic Count plate)是一种预先制备好的培养基系统,其培养基 为标准的平板计数琼脂(PCA)培养基,并且含菌落指示剂,菌落在测试片上呈红色,这样可增强菌落计 数效果。 菌落总数测试片(3M PetrifilmTM Rapid Aerobic Count Plate)是一种预先制备好的培养基系统,包 含营养成分、冷水可溶性凝胶及双联指示剂技术,菌落在测试片上呈红色和蓝色,24 h即可对食品基质 进行菌落计数。 1SN/T4544.2—2022 以正式出版文本为准6 仪器和设备 除微生物实验室常规灭菌和培养设备外,其他设备和材料如下: 6.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃,30 ℃±1 ℃。 6.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。 6.3 恒温水浴箱:46 ℃±1 ℃ 6.4 天平:感量为0.1 g。 6.5 均质器。 6.6 振荡器。 6.7 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度),10 mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 6.8 无菌锥形瓶:容量为250 mL、500 mL。 6.9 无菌培养皿:直径为90 mm。 6.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 6.11 放大镜或/和菌落计数器。 6.12 3M压板。 7 试剂和材料 7.1 菌落总数测试片:本文件使用的测试片3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate 和 3M PetrifilmTM Rapid Aerobic Count Plate由3M有限公司生产,参考SN/T 2775和SN/T 3266,按商品化食品检测试 剂盒评价程序进行评价,评价结果参见附录A和附录B。 7.2 磷酸盐缓冲液(PBS):按附录C中C.1。 7.3 无菌生理盐水:按附录C中C.2。 7.4 1 mol/L 氢氧化钠(NaOH):称取 40 g NaOH 溶于1 000 mL 蒸馏水中。 7.5 1 mol/L 盐酸(HCl):移取90 mL浓盐酸 ,用蒸馏水稀释至1 000 mL。 8 检测程序 菌落总数测试片检测程序见图1。 2SN/T4544.2—2022 以正式出版文本为准图1 菌落总数测试片检测方法程序 9 操作步骤 9.1 样品制备和稀释 9.1.1 按照GB 4789.2的方法制备1∶10样品匀液。无菌操作调节该样品匀液的pH为6.6~7.2, 酸性样液用1 mol/L 氢氧化钠(NaOH)调节,碱性样液用1 mol/L 盐酸(HCl)调节,或根据产品标准规 定的酸碱溶液来调节pH值。 9.1.2 按照 GB 4789.2方法吸取1∶10样品匀液,制备10倍系列稀释样品匀液。 9.2 接种 9.2.1 根据对样品污染情况的估计,选择2个~3个适宜稀释度样品匀液进行检验,根据需要选择3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate测试片或3M PetrifilmTM Rapid Aerobic Count Plate测试片。 9.2.2 将菌落总数测试片置于平坦表面处,揭开上层膜,吸取某一稀释度的1 mL样品匀液,垂直滴加 在测试片的中央处,然后将上层膜轻轻放下,将压板放置在上层膜中央处,轻轻的压下,使样液均匀覆盖 于圆形的培养面积上,切勿扭转压板。拿起压板,静置至少1 min以使培养基凝固。 9.2.3 每个稀释度接种两张测试片。同时,分别吸取1 mL空白稀释液加入两张测试片内作空白 对照。 3SN/T4544.2—2022 以正式出版文本为准9.3 培养 9.3.1 3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate培养 将测试片的透明面朝上,水平置于培养箱内,可堆叠至20片。在36 ℃±1 ℃条件下培养 48 h± 2 h,水产品 30 ℃±1 ℃培养72 h±3 h。 9.3.2 3M PetrifilmTM Rapid Aerobic Count Plate培养 在36 ℃±1 ℃条件下培养 24 h±2 h;如有产品标准等特殊要求,则按相应的标准或要求进行。 9.4 菌落计数 9.4.1 3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate计数 9.4.1.1 到培养时间应立即计数,选取菌落数在 30 CFU~300 CFU之间的测试片计数菌落总数,记 录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。 9.4.1.2 计数所有红色菌落。如果无法确定红点是菌落还是红色食品基质,可以延长培养24 h后观 察。如果红点变大则确定是菌落,如果红点未变大则确定是基质。 9.4.1.3 当细菌浓度很高时,整个测试片会变成红色,将结果记录为“多不可计”(too numerous to count,TNTC)。 9.4.1.4 3M PetrifilmTM Aerobic Count Plate有20个等分格,当菌落数量过多,计数困难时,可选择 几个有代表性菌落的小方格,计算平均菌落数,再乘以相应倍数,即可得到整个测试片上的估算菌落数。 9.4.1.5 一些微生物会液化凝胶,造成局部扩散或菌落模糊的现象。如果液化现象干扰计数,可以计 数未液化的面积来估算菌落浓度。 9.4.2 3M PetrifilmTM Rapid Aerobic Count Plate计数 9.4.2.1 到培养时间应立即计数,选取菌落数在 30 CFU~300 CFU之间的测试片计数菌落总数,记 录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits , CFU)表示。 9.4.2.2 计数所有蓝色和红色菌落。如果无法确定红点是菌落还是红色食品基质,可以延长培养 24 h后观察。如果红点变大则确定是菌落,如果红点未变大则确定是基质。 9.4.2.3 当细菌浓度很高时,整个测试片会变成红色或蓝色,将结果记录为“多不可计”(too numerous to count, TNTC)。 9.4.2.4 3M PetrifilmTM Rapid Aerobic Count Plate 有30个等分格,当菌落数量过多,计数困难时,可 选择几个有代表性菌落的小方格,计算平均菌落数,再乘以相应倍数,即可得到整个测试片上的估算菌 落数。 9.4.2.5 一些微生物会液化凝胶,造成局部扩散或菌落模糊的现象。如果液化现象干扰计数,可以计 数未液化的面积来估算菌落浓度。 10 结果和报告 菌落总数的计算方法和菌落总数报告的规则按照GB 4789.2。 4SN/T4544.2—2022 以正式出