ICS07.100.30 CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5367.1—2022 商品化试剂盒检测方法 单核细胞增生李斯特氏菌 方法一 Commercial kit method-Listeria monocytogenes-Test method Ⅰ 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 商品化试剂盒检测方法 单核细胞增生李斯特氏菌 方法一 SN/T 5367.1—2022 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 网址 www.customskb.com/book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数22千字 2022年 月第一版 2022年 月第一次印刷 印数 1— * 书号: 155175·703 定价12.00元 以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是SN/T 5367《商品化试剂盒检测方法 单核细胞增生李斯特氏菌》的第1部分。 SN/T 5367已经发布了以下部分: ———第1部分:商品化试剂盒检测方法 单核细胞增生李斯特氏菌 方法一。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国福州海关。 本文件主要起草人:曾静、赵晓娟、刘莉、王紫薇、付溥博、徐蕾蕊、马丹、郑晶。 ⅠSN/T5367.1—2022 以正式出版文本为准以正式出版文本为准商品化试剂盒检测方法 单核细胞增生李斯特氏菌 方法一 1 范围 本文件规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的环介导恒温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测(3M MDS 单增李斯特氏菌分子检测试剂盒)方法。 本文件适用于乳制品、肉制品、鱼类和海产品中单核细胞增生李斯特氏菌的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 4789.30 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法 SN/T 3266 食品微生物检验方法确认技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染,应由具备资格的工作人员检测单核细胞增生李斯特氏菌。 所有培养物、DNA提取物和废弃物应按照GB 19489和GB/T 27403中的有关规定执行。 5 技术概要 应用环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术进行单核细胞增生李斯特氏菌的筛选检测。根据单核细胞 增生李斯特氏菌属特有靶序列上的6个独立区域,采用6条特异引物通过稳定的Bst DNA聚合酶来驱 动扩增反应,在60 ℃左右完成恒温扩增。在环介导恒温核酸扩增反应中,焦磷酸盐(PPi)通过ATP-硫 酸化酶被转化成三磷酸腺苷(ATP)。荧光素酶利用ATP发光,实现实时检测。 6 试剂与材料 除有特殊说明外,所有实验室用试剂均为分析纯,实验用水符合GB/T 6682中一级水的规定。 1SN/T5367.1—2022 以正式出版文本为准6.1 3M MDS 单核细胞增生李斯特氏菌分子检测试剂盒:本试剂盒参考SN/T 2775和SN/T 3266由 国家认证认可监督管理委员会商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见附 录A。试剂盒避光储存于2 ℃~8 ℃,组成如下: a) 裂解溶液(透明管中的粉红溶液 LS管); b) 扩增试剂管(含有冻干试剂小球,黄色试管); c) 阳性对照(RC); d) 盖子(黄色盖)。 注: 如商品化试剂盒关键技术指标发生变动时,以试剂盒说明书操作为准。 6.2 单核细胞增生李斯特氏菌质控菌株(ATCC 13932)。 6.3 Demi-Fraser培养基(含柠檬酸铁铵):见B.1。 6.4 Fraser培养基(含柠檬酸铁铵):见B.2。 6.5 3% 84消毒液。 7 仪器和设备 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: a) 3M分子检测仪器; b) 移液器:量程10 μL~100 μL; c) 水浴锅或加热模块: 100 ℃±1 ℃; d) 均质器; e) 计时器; f) 恒温培养箱: 36 ℃±1 ℃; g) 电子天平: 感量 0.1 g。 8 检测程序 食品中单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测程序见图1。 2SN/T5367.1—2022 以正式出版文本为准图1 食品中单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测程序 9 操作步骤 9.1 样品制备、增菌培养 9.1.1 将Demi-Fraser肉汤培养基温度平衡到室温。 9.1.2 以无菌操作取样品25 g(mL)加入含有225 mL Demi-Fraser肉汤增菌液的均质袋中,在拍击式 均质器上连续均质2 min,于36 ℃±1 ℃培养28 h~30 h;奶酪和鱼类样品需进行二次增菌,于36 ℃± 1 ℃培养20 h~24 h,移取0.1 mL Demi-Fraser肉汤增菌液转种于10 mL Fraser肉汤增菌液内,于 36 ℃±1 ℃培养20 h~24 h。 9.2 细菌模板DNA的制备(裂解) 从9.1获得的Demi-Fraser肉汤增菌液或Fraser肉汤增菌液,采用如下方法制备模板DNA。 a) 将裂解溶液(LS)管的温度平衡到室温。 b) 用移液器吸取20 μL 9.1.2中增菌液转移到LS管内。 c) 当加热模块的温度达到100 ℃±1 ℃时,将无盖LS管放在加热模块中加热15 min±1 min,随 着温度的变化LS管中溶液的颜色会从粉红变为黄色。 d) 从加热模块中取出LS管,将其放在冷却架冷却5 min~10 min直至其颜色恢复为粉红色,即 为模板DNA。 3SN/T5367.1—2022 以正式出版文本为准9.3 环介导恒温核酸扩增(LAMP)反应 9.3.1 阴性对照、阳性对照设置 每次反应必须设置阴性对照和阳性对照。阴性对照以无菌增菌培养基(如Demi-Fraser肉汤)替代 DNA模板,请勿将水用做阴性对照。阳性对照为试剂盒提供的RC。每个样品设置两个平行反应。 9.3.2 扩增过程 9.3.2.1 吸取LS管中DNA模板20 μL至扩增试剂管(含有冻干试剂小球),成一定角度缓慢加入,以 避免搅动小球,轻轻上下吹吸5次,使小球溶解并充分混匀,加盖黄色盖子并确保盖子盖紧。 9.3.2.2 DNA模板添加顺序应为:待测样品、阴性对照和阳性对照,以避免交叉污染。 9.3.2.3 将反应管装进3M分子检测快速转移托盘,关闭并锁定托盘盖。 9.3.2.4 在3M分子检测软件中查看和确认配置的检测,在软件中单击启动按钮,仪器盖自动打开。 9.3.2.5 将3M分子检测快速转移托盘放入3M分子检测仪器并关闭盖,启动分析。 9.3.2.6 为了避免因为交叉污染而导致的假阳性结果,在分析完成后,将快速转移托盘浸入3% 84消 毒液1 h,且始终远离分析准备区。 9.4 结果观察 75 min完成扩增,仪器实时自动报告检测结果,具体结果见附录C。 10 结果报告 在阴性对照和阳性对照结果均有效的情况下: a) 阳性结果,对样品增菌液进一步按照GB 4789.30中操作步骤进行确认后报告检出单核细胞 增生李斯特氏菌; b) 阴性结果,报告未检出单核细胞增生李斯特氏菌; c) 若与上述条件均不符,则本次结果无效,应更换试剂按本方法重新检测。 4SN/T5367.1—2022 以正式出版文本为准