̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э I C S6 5.0 2 0 .0 1 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 8 0—2 0 2 2 筑紫蜗牛检疫鉴定方法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f E u h a d r a h e r k l o t s i (M a r t e n s ,1 8 6 1 ) 2 0 2 2-0 7-0 7发布 2 0 2 3-0 2-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国福州海关 。 本文件主要起草人 :林阳武、王沛、胡美玲、周卫川。 ⅠS N/T5 3 8 0—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 筑紫蜗牛检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了筑紫蜗牛 E u h a d r a h e r k l o t s i (M a r t e n s ,1 8 6 1)的检疫鉴定方法 。 本文件适用于筑紫蜗牛的检疫鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 S N/T 3 0 6 7—2 0 1 1 软体动物常规检疫规范 3 术语与定义 S N/T 3 0 6 7—2 0 1 1界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 壳口 ape r t u r e 贝壳开口部位 ,是蜗牛头和腹足的出口 。 注: 壳口形状多变 ,有圆形、椭圆形、卵圆形、马蹄形等 。 3.2 胼胝部 c a l l o s e 内唇贴覆于体螺层上形成胼胝部 。 3.3 矢囊 d a r t s a c k 矢囊是蜗牛生殖系统中一个藏有 1枚中空的钙质或壳质骨针的肌肉质的囊 。 注: 一般用长径与短径之比来描述矢囊的相对长度 。 3.4 鞭状体 f l age l l u m 鞭状体是蜗牛雄性生殖系统中的附器 ,一般由阴茎本体末端分枝形成鞭状体 。 3.5 口唇 l ip 贝壳壳口的边缘为口唇 。 注: 口唇按其在壳口中的位置不同可分为内唇 、外唇、轴唇、上唇和下唇 ,靠近螺轴的口唇即称轴唇 ,有些种类的轴 唇常外折导致脐孔部分或完全被覆盖 。 3.6 缝合线 s u t u r e 蜗牛贝壳各螺层之间下陷的连接处 。 注: 缝合线有深有浅 ,有简单的或锯齿形的 。 1S N/T5 3 8 0—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 4 基本信息 学名:E u h a d r a h e r k l o t s i (M a r t e n s ,1 8 6 1) 。 中文名:筑紫蜗牛 。 分类地位 :软体动物门 Mo l l u s c a ,腹足纲G a s t r opo d a,肺螺亚纲 P u l m o n a t a ,柄眼目S tyl o mm a - t op go r a,巴蜗牛科 B r a dyb a e n i d a e ,真厚螺属 E u h a d r a P i l s b ry,1 8 9 0。该属共有 2 2个种,其中左旋种有 5个,右旋种有 1 7个。筑紫蜗牛的近似种主要有阿玛丽真厚螺 E.a m a l i a e (K o b e l t,1 8 7 5)和亚颏真厚 螺E.s u b n i m b o s a (K o b e l t,1 8 9 4) 。筑紫蜗牛的其他信息见附录 A。 5 原理 筑紫蜗牛的传播特点是不需要特定的寄主 ,凡接触过的物品都可传播 。传播方式和生态习性是确 定现场检疫方式的依据 。贝壳形态 、生殖系统形态和分子特征是实验室鉴定的主要依据 。 6 器具和试剂 6.1 仪器和用具 仪器:体视显微镜 、微型离心机 、恒温金属浴 、P C R仪、凝胶成像系统 。 用具:放大镜、手电筒、塑料自封袋 、广口标本瓶 、4 mm孔径土壤筛 、小铁铲、游标卡尺 、搪瓷盘、培 养皿、镊子、剪刀、小剪刀、显微镊子 、显微剪刀 、微针(直径0. 1 5 mm) 、解剖蜡盘 、标签、1. 5 mL离心管、 0. 2 mL P C R反应管、移液枪。 6.2 试剂 除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 。 7 5%乙醇、无水乙醇 、硫酸镁、动物基因组 DNA提取试剂盒 、P C R M a s t e r M i x、d d H 2O。 7 现场检疫 对来自疫区 (见附录A)的运输工具和货物实施重点查验 。仔细检查运输工具 、木质包装材料 、未经 加工的植物性材料等是否有蜗牛附着 。筑紫蜗牛昼伏夜出 ,尤其要注意阴暗潮湿避光处的检查 ,用手电 筒仔细寻找蜗牛的行迹 。蜗牛爬行过后 ,一般都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹 ,这是判定是否有蜗牛 污染的重要依据 。若发现蜗牛 ,及时将其装入塑料自封袋或标本瓶带回实验室做进一步的检验鉴定 。 发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时 ,需过筛检查是否有卵或幼螺 。 8 实验室鉴定 8.1 饲养 单独查获的卵粒 ,按照S N/T 3 0 6 7—2 0 1 1中8. 4方法,将其孵化和饲养为成螺后 ,再做鉴定 。 8.2 测量、观察和软体解剖 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽 、卵粒直径 。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和 2S N/T5 3 8 0—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 螺的形态特征 。 将闷杀处理后的标本 ,按照S N/T 3 0 6 7—2 0 1 1中8. 3. 1进行软体解剖 ,分离出生殖系统 。 8.3 真厚螺属 E u h a d r a P i l s b ry,1 8 9 0鉴定特征 壳高1 1. 3 mm~3 8. 0 mm,壳宽2 0. 5 mm~5 7. 0 mm,个体较大 。呈矮圆锥形 ,壳质或薄或厚 ,有 5个~7个适度膨胀的螺层 。最后一个螺层圆形 ,在前方极度下陷 。壳面微黄色 、桃红色至黑色 ,大多数 情况下具有 3条黑色的色带或完全缺乏 ,有时有大理石样花纹或者浅的辐射状标记 。胚螺层光滑 ,次体 螺层有辐射状刻纹和螺旋状的凹痕 。壳口椭圆形或马蹄形 ,倾斜,口唇宽大且外折 ,颜色多变 ,从浅黄色 至深紫色 。脐孔大而深 ,周围紫褐色或与壳面颜色一致 。该属大多数种贝壳右旋 ,少数种贝壳左旋 。 8.4 筑紫蜗牛 E u h a d r a h e r k l o t s i (M a r t e n s,1 8 6 1)鉴定特征 8.4.1 卵 圆形,乳白色至黄色 ,直径2 mm左右。 8.4.2 贝壳 8.4.2.1 成螺 壳高1 1. 5 mm~2 5. 0 mm,壳宽2 0. 5 mm~3 6. 1 mm,贝壳大,壳质厚,坚实,呈矮圆锥形 。有 5个~6个螺层,前几个螺层缓慢增长 ,略膨胀,螺旋部低矮 。体螺层近圆形 ,膨大,其高度约为壳高的 2/3,在壳口处向右下方倾斜 。壳顶钝,缝合线深 。壳面颜色多变 ,乳白色、浅黄色、紫褐色,有稠密而较 粗的生长线和刻纹 。体螺层周缘有一条螺旋状的紫褐色条带 ,并向螺旋部延伸 ,逐渐靠近缝合线 ,最终 与缝合线完全重叠 。壳口马蹄形 ,向下倾斜 。口唇外折 ,厚,浅紫色。轴唇在脐孔处略外折 ,内唇贴覆于 体螺层上 ,形成稍厚的胼胝部 。脐孔大而深 ,呈洞穴状 ,周围紫褐色 (见图B. 1) 。 8.4.2.2 幼螺 幼螺贝壳外形与成螺基本相似 ,但个体较小 ,口缘不外折 。 8.4.3 螺体 浅褐色,软体背部颜色较深 。 8.4.4 生殖系统 矢囊大,副矢囊中等大小 ,为长柱形 。黏液腺约 1 3枝,呈放射状排列 。受精囊椭圆形 ,受精囊柄长 。 输卵管中等粗细 。输精管细 ,长度约为输卵管的 2. 5倍。鞭状体末端细小 。阴茎牵引肌略粗 ,短。阴茎 长,中等粗细 (见图B. 2) 。 8.4.5 C O I基因序列鉴定 按照附录 C规定的方法提取 DNA,P C R扩增和双向测序 ,将所测序列与 G e n b a n k 登录号为 MK 2 8 1 3 3 3 已知筑紫蜗牛的线粒体 CO I基因序列进行比对 ,相似度不小于 9 5%确定为筑紫蜗牛疑似 样品。 8.5 筑紫蜗牛与近似种的区别 筑紫蜗牛与其近似种的贝壳在螺旋部 、生长线、螺纹、脐孔、次体螺层螺旋状凹痕 、周缘棱角方面有 差异,详细鉴别特征见附表 D。 3S N/T5 3 8 0—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 9 结果判定 以贝壳形态和生殖系统形态为基本鉴定依据 ,螺体的特征作为参考 ,分子检测为辅助鉴定方法 ,并 注意与近似种的鉴别 (见附录D) 。 符合8. 4. 2或同时符合 8. 4. 3、8. 4. 4形态特征的蜗牛判定为筑紫蜗牛 。 单独查获的卵粒符合 8. 4. 1形态特征 ,需通过孵化和饲养实验 ,做进一步的鉴定 。 符合8. 4. 5确定为筑紫蜗牛的疑似样品 ,需进一步进行形态鉴定 。 1 0 标本处理和保存 1 0.1 标本处理 标本处理按照 S N/T 3 0 6—2 0 1