̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э I C S 6 7.0 2 0.0 1 C C S B 1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 4 6 2—2 0 2 2 金钗石斛鉴定方法 I d e n t i f i c a t i o n o f D e n d r o b i u m n o b i l e L i n d l . 2 0 2 2-0 7-0 7发布 2 0 2 3-0 2-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国海口海关 、中华人民共和国拱北海关 、中华人民共和国重庆海关 、 中华人民共和国福州海关 。 本文件主要起草人 :潘英文、刘福秀、张卫东、谢添伟、李佳潼、孙涛、于文涛、王安石、陈施明、韩松、 林明光。 ⅠS N/T5 4 6 2—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 金钗石斛鉴定方法 1 范围 本文件规定了金钗石斛的形态学和 DNA条形码鉴定方法 。 本文件适用于金钗石斛的鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 萼片 s epa l 花的外轮花被片 。 注: 包括1片中萼片 (背萼片)和2片侧萼片 。 3.2 萼囊 m e n t u m 蕊柱足和着生于其两侧的两片侧萼片基部以及着生于其顶端的唇瓣基部组成的囊状部分 。 3.3 花瓣 pe t a l 内轮花被片中的左右两片 。 3.4 唇瓣 l a b e l l u m 内轮花被片中央的 1片变态而成 ,常有鲜艳的色泽和复杂的结构 。 3.5 蕊柱 c o l u m n 雌雄蕊融合而成的柱状器官 。 4 基本信息 中文名:金钗石斛 学名:D e n d r o b i u m n o b i l e L i n d l . 分类地位 :被子植物 A ngi o spe r m s,单子叶植物分支 Mo n o c o t s ,天门冬目 A spa r aga l e s,兰科O r c h i - d a c e a e,石斛属D e n d r o b i u m 1S N/T5 4 6 2—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 金钗石斛的其他资料见附录 A和附录B。 5 方法原理 金钗石斛的茎 、叶、花等形态学特征作为其鉴定的主要依据 ,基于I T S序列特征的分子生物学鉴定 作为形态学鉴定的辅助手段 。 6 鉴定方法 6.1 形态学鉴定 茎直立,肉质状肥厚 ,稍扁的圆柱形 ,长1 0 c m~6 0 c m,粗达1. 3 c m,上部多少回折状弯曲 ,基部明 显收狭,不分枝,具多节;节间多少呈倒圆锥形 ,长2 c m~4 c m,干后金黄色 。叶革质,长圆形,长6 c m~ 1 1 c m,宽1 c m~3 c m,先端钝并且不等侧 2裂,基部具抱茎的鞘 。总状花序从具叶或落了叶的老茎中 部以上部分发出 ,长2 c m~4 c m,具1朵~4朵花;花序柄长 5 mm~1 5 mm,基部被数枚筒状鞘 ;花苞 片膜质,卵状披针形 ,长6 mm~1 3 mm,先端渐尖 ;花梗和子房淡紫色 ,长3 mm~6 mm;花大,白色带 淡紫红色先端 ,有时全体淡紫红色或除唇盘上具 1个紫红色斑块外 ,其余均为白色 ;中萼片长圆形 ,长 2. 5 c m~3. 5 c m,宽1. 0 c m~1. 4 c m,先端钝,具5条脉;侧萼片相似于中萼片 ,先端锐尖 ,基部歪斜 ,具 5条脉;萼囊圆锥形 ,长6 mm;花瓣多少斜宽卵形 ,长2. 5 c m~3. 5 c m,宽1. 8 c m~2. 5 c m,先端钝,基 部具短爪 ,全缘,具3条主脉和许多支脉 ;唇瓣宽卵形 ,长2. 5 c m~3. 5 c m,宽2. 2 c m~3. 2 c m,先端钝, 基部两侧具紫红色条纹并且收狭为短爪 ,中部以下两侧围抱蕊柱 ,边缘具短的睫毛 ,两面密布短绒毛 ,唇 盘中央具 1个紫红色大斑块 ;蕊柱绿色 ,长5 mm,基部稍扩大 ,具绿色的蕊柱足 ;药帽紫红色 ,圆锥形, 密布细乳突 ,前端边缘具不整齐的尖齿 。 6.2 分子生物学鉴定 6.2.1 D N A制备与P C R检测 DNA制备与P C R检测按附录 C执行。 6.2.2 测序与序列分析 P C R扩增产物经 1. 5 %琼脂糖凝胶电泳分离 ,目的片段使用 DNA产物纯化试剂盒纯化并测序 。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑 ,对比峰图 ,判断序列方向 ,去除测序引物序列 。 登录G e n B a n k 数据库B LA S T 鉴定系统 (h t tp: / /b l a s t . n c b i . n l m. n i h. go v/B l a s t . cgi) ,通过比对查 询相似度最高的物种 。 6.2.3 金钗石斛 I T S基因序列 金钗石斛 I T S基因序列 G e n B a n k 登录号:MT 9 4 0 4 4 0. 1 。 7 结果判定 样品茎、叶、花等形态学特征与 6. 1的描述相符 ,且样品I T S序列与G e n B a n k 数据库比对结果给出 最大近似种金钗石斛且相似度大于 9 9%,则判定为金钗石斛 。 2S N/T5 4 6 2—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 8 标本与原始数据保存 8.1 标本保存 样本应注明来源 、时间、地点及鉴定者等信息 ,保存期为 1年,以备复验 ,如涉及贸易纠纷则应保存 到纠纷解决完毕 。保存期满后 ,按后期用途长久保存或处理 。 8.2 原始数据保存 样品检测结束后 ,其原始记录单和检验报告应归档 ,妥善保管 ,以备复验 、谈判和仲裁 。 3S N/T5 4 6 2—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 附 录 A (资料性) 金钗石斛及其近似种分种检索表 1 a.萼片和花瓣淡黄色 、奶黄色至金黄色 ,除唇瓣外决不带紫色或其他颜色 。 2 a.茎上部常分枝 ;叶狭长圆形 ,宽不及7 mm,先端2圆裂 细叶石斛 D. h a n c o c k i i R o l f e ……………… 2 b.茎不分枝 ;叶宽1 c m以上,先端锐尖 、不裂。 3 a.花单生于叶腋 ,干后蜡质 ;唇瓣卵状菱形 ,无任何斑纹 …罗河石斛 D. l o h o h e n s e T. T a ng e t F. T. W a ng 3 b.花通常2朵至多朵组成总状花序或伞形花序 ,极罕为单花 ,干后不为蜡质 。 4 a.伞形花序几乎无花序柄 ,每2朵~ 6朵花为一束 ;唇盘具2个紫红色斑块 …束花石斛 D. c h rys a n t h u m L i n d l . 4 b.总状花序 。 5 a.茎上下一致的圆柱形 ,节和节间不肿胀 。 6 a.花序出自落了叶的茎上 。 7 a.花序轴长不及 5 c m 黄花石斛 D. d i x a n t h u m R c h b. f . ……………………………………………… 7 b.花序轴长 1 0 c m以上。 8 a.唇瓣近圆形 ,凹陷成兜状 ,基部两侧各具 1个淡紫褐色斑块 杓唇石斛 D. m o s c h a t u m (B u c h . - H a m. )S w. …… 8 b.唇瓣近圆形 ,不凹陷成兜状 。 9 a.花序柄基部被覆着长 5 mm~2 0 mm、套叠的大鞘 ;花苞片大 ,舟状,长1. 8 c m~3. 0 c m………… 线叶石斛 D. a u r a n t i a c u m R c h b. f . …………………………………………………………………… 9 b.花序柄基部被覆着长 3 mm~1 0 mm、套叠的小鞘 ;花苞片小 ,卵形,长约5 mm。 1 0 a .唇瓣圆形 ,具1个横生的半月形的深紫色斑块 ,边缘其复流苏 流苏石斛 D. fi m b r i a t u m H o o k . ………… 1 0 b.唇瓣近圆形 ,具2个栗色斑块 ,边缘稍啮蚀状 曲轴石斛 D. gi b s o n i i L i n d l . ……………………… 5 b.茎常在中部或中部以上的节间增粗 ,有时呈纺锤形或稍呈棒状 。 1 1 a.花奶黄色或淡黄色 ;唇瓣卵状披针形 ,边缘不具流苏 尖刀唇石斛 D. h e t e r o c a r pu m L i n d l . ……… 1 1 b.花金黄色 。 1 2 a.唇瓣近肾形 ,基部两侧具红色条纹 ,边缘无流苏 短棒石斛 D. c api l l ipe s R c h b. f . ……………