̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.01 CCSB 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5469—2022 铁皮石斛鉴定方法 Detection and identification of Dendrobium catenatum Lindl. 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国拱北海关技术中心、中华人民共和国上海海关动植物与食品检验 检疫技术中心、中华人民共和国杭州海关技术中心、中华人民共和国海口海关热带植物隔离检疫中心。 本文件主要起草人:张卫东、李伟刚、水克娟、薛华杰、张明哲、潘英文、黄永辉、权永兵、徐淼锋、廖 力、林伟、闫邦奇。 ⅠSN/T5469—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 铁皮石斛鉴定方法 1 范围 本文件描述了铁皮石斛的形态学和DNA条形码检验鉴定方法。 本文件适用于铁皮石斛及其产品的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 萼片 sepal 花的外轮花被片。 注: 包括1片中萼片(背萼片)和 2片侧萼片。 3.2 花瓣 petal 内轮花被片中的左右两片。 3.3 蕊柱 column 融合有雄性及雌性生殖器官的柱状结构。 3.4 唇瓣 labellum 内轮花被片中央的1片变态而成,常有鲜艳的色泽和复杂的结构。 4 铁皮石斛基本信息 学名:Dendrobium catenatum Lindl. 中文名:铁皮石斛 异名:Dendrobium officinale Kimura & Migo;Dendrobium tosaense Makino;Dendrobium funius- hanense T.B.Chao, Z.X.Chen & Z.K.Chen;Dendrobium perefauriei Hayata;Dendrobium strick- landianum Rchb.f.;Callista stricklandiana (Rchb.f.) Kuntze 俗名:黑节草、黄石斛 分类地位:被子植物Angiosperms,单子叶植物分支 Monocots,天门冬目Asparagales,兰科Orchi- 1SN/T5469—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э daceae,石斛属Dendrobium。 5 方法原理 根据石斛属的内转录间隔区 (internal transcribed spacer 2,ITS2)序列特征,应用DNA条形码技 术对铁皮石斛进行鉴定,通过肉眼、放大镜和体视显微镜观察铁皮石斛的茎、叶和花等形态特征进行种 类鉴定。 6 主要仪器设备、用具和试剂 6.1 主要仪器设备 PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、体视显微镜、生物显微镜、分析天平(感量0.1 mg)、低温冷冻 高速离心机、微量分光光度仪、组织研磨器、生物安全柜、冰箱。 6.2 用具 移液器(1 000 μL、200 μL、100 μL、10 μL、2.5 μL)及配套枪头、放大镜、离心管、研钵、镊子等。 6.3 主要试剂 Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、PVP40、β-巯 基乙醇、蛋白酶K(20 mmol/μL)、RNase A、液氮、TE缓冲液、10×PCR缓冲液、氯化镁(25 mmol/L)、 dNTP(10 mmol/L)、Taq酶(5 U/μL)、引物、琼脂糖、DNA分子量标记和电泳缓冲液。 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,试验用水应符合GB/T 6682中相关规定。 7 鉴定方法 7.1 形态学鉴定 通过肉眼、放大镜和体视显微镜观察铁皮石斛的茎、叶和花,依据其与近似种的形态特征(参见附录 A、附录B)进行种类鉴定。 7.2 分子生物学检测 7.2.1 DNA提取 铁皮石斛DNA提取方法按附录C执行。 7.2.2 PCR检测 铁皮石斛PCR检测应设置空白核酸提取对照和空白扩增对照,每个样品设置两个平行反应,具体 方式按照GB/T 19495.2中相关规定进行。 具体操作按附录D执行,铁皮石斛及常见近似种ITS2基因序列表信息参见附录E。 8 形态学鉴定特征 8.1 石斛属主要形态特征 附生草本。茎丛生,少有疏生在匍匐茎上的,直立或下垂,圆柱形或扁三棱形,不分枝或少数分枝, 2SN/T5469—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 具少数或多数节,有时1至数个节间膨大成种种形状,肉质(亦称假鳞茎)或质地较硬,具少数至多数叶。 叶互生,扁平,圆柱状或两侧压扁,先端不裂或2浅裂,基部有关节和通常具抱茎的鞘。总状花序或有时 伞形花序,直立,斜出或下垂,生于茎的中部以上节上,具少数至多数花,少有退化为单朵花的;花小至 大,通常开展;萼片近相似,离生;侧萼片宽阔的基部着生在蕊柱足上,与唇瓣基部共同形成萼囊;花瓣比 萼片狭或宽;唇瓣着生于蕊柱足末端,3裂或不裂,基部收狭为短爪或无爪,有时具距;蕊柱粗短,顶端两 侧各具1枚蕊柱齿,基部具蕊柱足;蕊喙很小;花粉团蜡质,卵形或长圆形,4个,离生,每2个为一对,几 无附属物。 8.2 铁皮石斛形态特征 8.2.1 基本生物学特性 多年生草本。 8.2.2 植株形态特征 8.2.2.1 茎 铁皮石斛的茎直立,圆柱形,长约9 cm~35 cm,粗2 mm~4 mm,不分枝,具多节,节间长1.3 cm ~1.7 cm。 8.2.2.2 叶 叶二列,互生于茎的中部以上,通常3枚~5枚,纸质,长圆状披针形,长3 cm~4 cm,宽9 mm~ 11 mm,先端钝并且多少有钩转,基部下延为抱茎的鞘,边缘和中脉常带淡紫色。叶鞘常具紫斑,老时其 上缘与茎松离而张开,并且与节留下1个环状铁青的间隙。 8.2.2.3 花 总状花序从落了叶的老茎上部发出,通常2朵~3朵花。花序柄长5 mm~10 mm,基部具2枚~ 3枚短鞘,花序轴回折状弯曲,长2 cm~4 cm。花苞片干膜质,浅白色,卵形,长5 mm~7 mm,先端稍 钝。花梗和子房长2 cm~2.5 cm。萼片和花瓣为黄绿色,长圆状披针形,长约1.8 cm,宽4 mm~ 5 mm,先端锐尖,具5条脉,侧萼片基部较宽阔,宽约1 cm。唇瓣白色,基部具1个绿色或黄色的胼胝 体,卵状披针形,比萼片稍短,中部反折,先端急尖,不裂或不明显3裂,中部以下两侧具紫红色条纹,边 缘多少呈波状。唇盘密布细乳突状的毛,并且在中部以上具1个紫红色斑块。萼囊圆锥形,长约 5 mm,末端圆形。蕊柱黄绿色,长约3 mm,先端两侧各具1个紫色斑点。蕊柱足黄绿色带紫红色条 纹,疏生毛。药帽白色,长卵状三角形,长约2.3 mm,顶端近锐尖且2裂。 8.3 铁皮石斛与近似种的主要区别 铁皮石斛与近似种的主要区别参见附录B。 9 结果判定 9.1 形态学结果判定 以茎、叶、花的形态特征为依据,符合8.2所描述的形态鉴定特征的,判定为铁皮石斛。 9.2 分子生物学结果判定 送检样品ITS2基因序列结果与铁皮石斛基因序列相似性最高,最大相似度在 99% 以上,且形态 3SN/T5469—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 学特征符合8.2描述的形态鉴定特征的,判定为铁皮石斛。 送检样品ITS2基因序列结果与铁皮石斛基因序列相似性低于99%,判定为非铁皮石斛。 10 标本和样品的保存和处理 10.1 标本和样品的保存 样品应在低温的条件下保存,保存期为1年,以备复验。 10.2 结果记录与资料保存 完整的试验记录包括:样品的来源、种类、时间,试验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字。检测需有最终的试验数据、电泳结果照片等。原始数据应归档,妥善保管,以备复验、 谈判和仲裁。 10.3 样品处理 保存期满后,样品经灭活后妥善处理。 4SN/T5469—2022