̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS67.050 CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5513—2023 出口禽肉中弯曲菌计数方法 Enumeration of Campylobacter spp. in poultry for export 2023-11-01发布 2024-05-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 出口禽肉中弯曲菌计数方法 SN/T 5513—2023 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1 字数29千字 2024年4月第一版 2024年4月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·1045 定价18.00元̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国青岛海关技术中心、临沂大学、北京陆桥技术股份有限公司、杭州 海关技术中心。 本文件主要起草人:贾俊涛、王萍、于娟娟、唐静、王伟、黄小华、赵晗、段效辉、杨捷琳、姜英辉、 刘云国、袁涛、殷培军、李正义、马云、徐玮、张秋艳、吴丽娜、谢文。 ⅠSN/T5513—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 出口禽肉中弯曲菌计数方法 1 范围 本文件规定了禽肉弯曲菌计数方法。 本文件适用于禽肉(整禽冲洗液、生禽分割产品以及涂抹样品)的弯曲菌的计数。第一法适用于弯 曲菌含量较高的禽肉中弯曲菌的计数;第二法适用于弯曲菌含量较低的禽肉中弯曲菌的计数。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 0175 进出口食品中弯曲菌的检测方法 SN/T 4092 微生物学检测的胴体采样方法 SN/T 4426 出口食品加工卫生表面取样技术方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 弯曲菌 Campylobacter spp. 41.5 ℃微需氧条件下,在mCCD琼脂平板上形成特征菌落的一群微生物,该菌在显微镜下呈现弯 曲杆状和螺旋形运动,在25 ℃有氧条件下不生长,氧化酶呈阳性。 4 设备和材料 4.1 天平:感量0.1 g。 4.2 微需氧培养装置:厌氧罐、厌氧盒或密封袋、微需氧产气袋和氧气指示剂。如有条件可配微需氧恒 温工作站。最佳微需氧条件为5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。 4.3 培养箱:25 ℃±1 ℃,30 ℃±1 ℃,36 ℃±1 ℃ 和 42 ℃±1 ℃。 4.4 拍击式均质器和配套无菌均质袋:最大容量至少500 mL。 4.5 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度),10 mL(具0.1 mL刻度)。 4.6 可调移液器:100 μL~1 000 μL,1 mL~10 mL,配无菌吸头。 4.7 无菌涂布棒:玻璃或塑料材质。 4.8 培养皿:玻璃或塑料材质,直径90 mm。 4.9 显微镜:光学显微镜,如有条件可配相差显微镜。 4.10 载玻片和盖玻片。 1SN/T5513—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 5 培养基和试剂 5.1 中和缓冲蛋白胨水(NBPW),按照A.1执行。 5.2 磷酸盐缓冲液,按照A.2执行。 5.3 生理盐水,按照A.3执行。 5.4 Bolton肉汤,按照A.4执行。 5.5 mCCD(mCCD)琼脂平板,按照A.5执行。 5.6 哥伦比亚血琼脂平板(Columbia blood agar),按照A.6执行。 5.7 氧化酶试纸。 6 样品的运送和保存 在样品的运送及保存过程中不得将样品冷冻,同时注意不使样品干燥,应在 4 ℃±2 ℃温度条件下 保存并尽快进行检测。 注: 弯曲菌在低温下存活时间较长,但是冷冻状态下可能导致该菌的失活。 第一法 弯曲菌平板计数法 7 操作步骤 7.1 样品制备 7.1.1 整禽冲洗 按附录B的方法使用400 mL 已预冷至4 ℃±2 ℃的NBPW冲洗,冲洗后的液体作为初始样品 匀液。 7.1.2 生禽分割产品 根据要求称取一定量(不低于25 g)的生禽分割产品,加入 9 倍量(如果称样量 25 g 就是 225 mL) 已预冷至 4 ℃±2 ℃的NBPW,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min制成 1∶10 初始样品匀液。 7.1.3 涂抹样品 按 SN/T 4092或SN/T 4426的方法涂抹样品,将涂抹后的棉签或其他材料(如滤纸片、涂抹海绵) 放入其蘸取的NBPW中。折断涂抹材料根部(如果有)让其完全浸入稀释液中,振荡或反复挤压使其成 为初始样品匀液。注意手不要触碰落入稀释液中的材料部分。记录下单位涂抹面积对应初始样品匀液 的体积,例如:涂抹25 cm2的表面,浸入25 mL NBPW,1 mL初始样品匀液代表1 cm2的涂抹面积。 7.2 样品稀释 用1 mL无菌吸管或移液器吸取1 mL初始样品匀液沿管壁缓缓注入盛有9 mL磷酸盐缓冲液或 生理盐水的无菌容器中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇。根据对样品污染状况的估计, 按前述操作,依次制成10倍系列稀释样品匀液。 2SN/T5513—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 7.3 接种和培养 选取2 个~3个适宜的连续稀释度,初始样品匀液也算作一个稀释度。每个稀释度吸取0.1 mL稀 释液加入一块mCCD琼脂平板,然后尽可能快地用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。 如果预估样品中弯曲菌含量较低,还需要接种1 mL初始样品匀液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量 分别加入3块mCCD琼脂平板,按前述方法涂布。 微需氧条件下42 ℃±1 ℃培养40 h~48 h。 7.4 平板计数 弯曲菌菌落在mCCD琼脂平板上菌落通常为淡灰色,有金属光泽、潮湿、扁平,呈扩散生长的倾向, 也会有其他形态的菌落出现。 选择平板上不超过150个可疑菌落的平板,计数可疑菌的数量。如果接种了1 mL样品匀液,将3 块平板计数相加,其余接种0.1 mL稀释液的稀释度单独计数平板上可疑菌的数量。 7.5 确证试验 7.5.1 试验要求 每个稀释度的平板上至少选取5个可疑菌落(小于5个全选)进行确证试验。用接种环挑取可疑菌 落,划线接种于哥伦比亚血平板,微需氧条件下42 ℃±1 ℃培养24 h~48 h。对新鲜纯培养物按 7.5.2~7.5.5进行确证试验,也可选用其他经验证的等效方法进行确证。 7.5.2 形态和运动性 用显微镜对新鲜纯培养物进行形态和运动性的观察。 弯曲菌在显微镜下如小逗点状,两菌体的末端相接时呈S形、螺旋状或海鸥展翅状,呈现螺旋状(如 同红酒开瓶器的螺丝钻头)运动。 符合弯曲菌特征形态和运动性的纯培养物继续进行后续确证试验。 7.5.3 25 ℃好氧生长 挑取一环纯培养物划线接种于哥伦比亚血平板,有氧条件下25 ℃±1 ℃培养40 h~48 h。 有菌落生长为阳性。弯曲菌呈现阴性结果。 7.5.4 氧化酶 挑取纯培养物至润湿的氧化酶试纸上,如果在10 s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。弯曲 菌呈现阳性结果。 注: 镍铬材质的接种环不能用于氧化酶试验。mCCD琼脂平板上生长的弯曲菌菌落直接进行氧化酶试验,可能会 出现假阴性结果。 7.5.5 鉴定(可选) 如需鉴定到种,可以参考SN/T 0175的鉴定方法,也可选用其他经验证的等效方法进行鉴定。 7.6 结果计算 当仅有一个稀释度平板的可疑菌落数在计数范围内时,按公式(1)计算: T=A×B C×d×V ………………………… ( 1 ) 3SN/T5513—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 式中: T———初始样品匀液中弯曲菌菌落数,CFU/mL; A———某一稀释度可疑菌菌落的总数,CFU; B———某一稀释度确证为阳性的菌落数,CFU; C———某一稀释度用于确证试验的菌落数,CFU; d———稀释因子; V———接种体积,mL。 当有两个及以上稀释度平板的可疑菌落数在计数范围内时,选取菌落数多的2个连续稀释度,按 公式(2)计算。 T=A1B1/C1+A2B2/C2 1.1dV …………………………( 2 ) 式中: T———初始样品匀液中弯曲菌菌落数,CFU/mL; A1———第一稀释度(低稀释倍数)可疑菌菌落的总数,CFU; B1———第一稀释度(低稀释倍数)确证为阳性的菌落数,CFU; C1———第一稀释度(低稀释倍数)用于确证试验的菌落数,CFU; A2———第二稀释度(高稀释倍数)可疑菌菌落的总数,CFU; B2———第二稀释度(高稀释倍数)确证为阳性的菌落数,CFU; C2———第二稀释度(高稀释倍数)用于确证试验的菌落数,CFU; d———第一稀释度(低稀释倍数)稀释因子; V———第一稀释度(低稀释倍数)接种体积,mL; 1.1———计算