̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS07.100.30 CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5516.16—2023 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换 核酸扩增(RAA)检测方法 第16部分:创伤弧菌 Real-time recombinase-aid amplification detection method for pathogens in export food—Part 16:Vibrio vulnificus 2023-05-05发布 2023-12-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是SN/T 5516《出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(RAA)检测方法》的 第16部分。SN/T 5516已经发布了以下部分: ———第1部分:沙门氏菌; ———第2部分:志贺氏菌; ———第3部分:金黄色葡萄球菌; ———第4部分:副溶血性弧菌; ———第5部分:克罗诺杆菌属; ———第6部分:大肠埃希氏菌O157; ———第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌; ———第8部分:空肠弯曲菌; ———第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌; ———第10部分:小肠结肠炎耶尔森氏菌; ———第11部分:肺炎克雷伯氏菌; ———第12部分:铜绿假单胞菌; ———第13部分:蜡样芽孢杆菌; ———第14部分:产气荚膜梭菌; ———第15部分:霍乱弧菌; ———第16部分:创伤弧菌。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、南京农业大学、中华人民共和国青岛海关、大连民族 大学。 本文件主要起草人:薛峰、梁莹、申进玲、蒋原、曹际娟、贾俊涛、汤芳、郭晨瑶、郝林慧。 ⅠSN/T5516.16—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换 核酸扩增(RAA)检测方法 第16部分:创伤弧菌 1 范围 本文件规定了出口食品中创伤弧菌的荧光重组酶介导链替换核酸扩增(RAA)检测方法。 本文件适用于出口食品中创伤弧菌的快速筛选。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 4789.44 食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 实时荧光RAA real time RAA RAA是一种核酸恒温扩增技术,在恒温下(一般为37 ℃~42 ℃),重组酶和寡核苷酸引物结合形 成蛋白-DNA复合物,该复合物能够移动寻找模板DNA中的同源序列,在单链DNA结合蛋白的帮助 下,打开模板DNA的双链结构,在DNA聚合酶的作用下,形成新的双链,产物呈指数级扩增。在exo 探针中包含一个四氢呋喃残基(THF),其两侧分别为dT-荧光基团(FAM)和dT-淬灭基团(BHQ-1)。 探针3’端通过适当的修饰(C3 Spacer)被封闭,以阻止聚合酶的进一步延伸。只有当探针和目的DNA 结合后,核酸外切酶III(Exonuclease III,ExoIII)能够识别并切除THF残基,并解除3’端阻断,荧光基 团和淬灭基团分开并产生荧光信号,RAA产物与荧光信号的增长存在对应关系。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1:黑洞淬灭基团1(black hole quencher 1) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) Exo III:核酸外切酶 III(Exonuclease III) FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein) 1SN/T5516.16—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э PEG:聚乙二醇(polyethylene glycol) RAA:重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase-aid amplification) Tricine:三(羟甲基)甲基甘氨酸(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl] glycine) vvhA基因:溶细胞素基因(cytolysin) 4 技术概要 以提取的DNA为模板,采用创伤弧菌特异性RAA引物和exo探针,进行实时荧光RAA的扩增, 根据实时荧光RAA的增幅情况,实现对食品中创伤弧菌的快速筛选。 5 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB/T 6682一级水的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 5.1 检测用引物(对)序列和探针 根据创伤弧菌vvhA基因设计的上下游引物和一条exo探针,详见表1。 表1 引物和探针序列 名称 序列(5'-3') 目的基因 上游引物vvhA-FTTCCAACTTCAAACCGAACTATGACGTTTTGT 下游引物vvhA-RTGGATGATTCCAGTCGATGCGAATACGTTGT exo探针vvhA-PAACTCAACTATCGTGCACGCTTTGGTACGGT(FAM)-THFA-T (BHQ1)-CCCTTCAGCACTCTT-C3 SpacervvhA基因 5.2 试剂 5.2.1 细菌DNA提取试剂盒。 5.2.1 RAA反应缓冲液:20% PEG。也可采用等效的商品试剂盒。 5.2.1 280 mmol/L乙酸镁。 5.2.1 冻干酶制剂:1 mmol/L dNTP、90 ng/μL单链结合蛋白、120 ng/μL recA重组酶、30 ng/μL Bsu DNA聚合酶、30 ng/μL ExoIII,100 mmol/L Tricine、5 mmol/L 二硫苏糖醇、100 ng/μL肌酸激 酶,保存于200 μL反应管中冻干。也可采用等效的商品试剂盒。 5.2.1 阳性对照:创伤弧菌标准菌株,或含目的片段的DNA。 6 仪器和设备 6.1 荧光检测仪:具有恒温(39 ℃±1 ℃)扩增功能的荧光检测仪。 6.2 微量移液器:100 μL~1 000 μL,20 μL~200 μL,10 μL~100 μL,0.5 μL~10 μL,并配备与移液 器匹配的吸头。 6.3 高速台式离心机:离心力≥12 000×g。 6.4 恒温金属浴:100 ℃±1 ℃。 2SN/T5516.16—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.5 天平:感量0. 0 1 g。 7 检测程序 食品中创伤弧菌实时荧光 RAA检测程序见图 1。 图1 食品中创伤弧菌实时荧光 R A A检测程序 8 操作步骤 8.1 样品制备 、增菌培养 按照G B 4 7 8 9. 4 4 的方法进行样品制备和增菌 。 8.2 细菌模板 D N A的制备 8.2.1 增菌液模板 D N A的制备 对于8. 1获得的增菌液 ,吸取1 mL菌液加入 1. 5 mL离心管中 ,1 2 0 0 0×g离心2 m i n,弃上清。 采用试剂盒中的细菌悬浮液重悬细菌 ,并按照细菌 DNA提取试剂盒说明书制备模板 DNA。 3S N/T5 5 1 6.1 6—2 0 2 3̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 8.2.2 可疑菌落模板DNA的制备 对于分离到的可疑菌落,可直接挑取可疑单菌落于100 μL无菌水混匀,沸水浴10 min,立即置冰 上冷却,12 000×g离心2 min,上清液即为模板DNA。也可使用等效的商品化细菌DNA提取试剂盒 并按其说明书制备模板DNA。 8.3 实时荧光RAA扩增 8.3.1 实时荧光RAA反应体系 创伤弧菌RAA检测,50 μL反应体系见表2。 表2 创伤弧菌实时荧光RAA反应体系 组分名称体积 μL RAA反应缓冲液 25 vvhA-F(10 μmol/ L) 2.1 vvhA-R(10 μmol/ L) 2.1 vvhA-P(10 μmol/ L) 0.6 DNA模板(20 ng/μL) 4.0 无菌双蒸水 13.7 乙酸镁(280 mmol/L) 2.5 总量 50 注1: DNA模板量可根据不同样品,具体情况进行调整。 注2: 将除乙酸镁和模板DNA以外的所有成分涡旋混匀,分装混合液至含有冻干酶制剂的200 μL反应管中,轻 柔手弹使冻干粉充分重溶均匀,短暂离心,打开反应单元,向每个反应单元的管盖上加入2.5 μL乙酸镁,然 后向各反应单元加入模板DNA,充分混匀并离心。 注3: 可使用等效的商品化荧光RAA试剂盒按照其说明书进行检测。 8.3.2 反应条件 将反应管置于荧光检测仪中,39 ℃,20 min。在反应过程中实时监测荧光信号。 8.4 实验对照 检测过程中分别设空白对