̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS67.180 CCSX11 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5522.6—2023 食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光PCR法 第6部分:山药淀粉 Identification of plant derived materials in edible starches real-time PCR method—Part 6:Starch of rhizoma dioscoreae 2023-05-05发布 2023-12-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是SN/T 5522《食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光PCR法》的第6部分。 SN/T 5522已经发布了以下部分: ———第1部分:红薯淀粉; ———第2部分:木薯淀粉; ———第3部分:马铃薯淀粉; ———第4部分:藕淀粉; ———第5部分:葛根淀粉; ———第6部分:山药淀粉; ———第7部分:玉米淀粉; ———第8部分:小麦淀粉; ———第9部分:绿豆淀粉; ———第10部分:豌豆淀粉。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国合肥海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海海关。 本文件主要起草人:韩建勋、陈颖、张九凯、邢冉冉、宗凯、王娉、宋蓉蓉、邓婷婷。 ⅠSN/T5522.6—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 引 言 淀粉掺假损害了消费者的利益,扰乱了市场,对淀粉应用产生很大负面影响。为此,有必要建立快 速、特异性好、灵敏度高的食用淀粉植物源性成分的检测方法。实时荧光PCR检测方法以其方便、快 速、准确等特点,从基因水平分析原料和产品的来源与特性,特异性强、灵敏度高,在食品种类鉴别、产地 溯源等食品真伪鉴别研究中得到了广泛应用。 该系列标准的制定及推广为保障食用淀粉的质量,保护消费者知情权和选择权,维护正常的经济秩 序等提供了技术支持。所建立的方法可应用于农业系统、质量技术监督局、食品加工生产企业等单位, 具有巨大的经济和社会效益,将为我国检验技术的提高和社会进步做出积极的贡献。 SN/T 5522《食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光PCR法》包括以下部分: ———第1部分:红薯淀粉; ———第2部分:木薯淀粉; ———第3部分:马铃薯淀粉; ———第4部分:藕淀粉; ———第5部分:葛根淀粉; ———第6部分:山药淀粉; ———第7部分:玉米淀粉; ———第8部分:小麦淀粉; ———第9部分:绿豆淀粉; ———第10部分:豌豆淀粉。 ⅡSN/T5522.6—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 食用淀粉植物源成分鉴别方法 实时荧光PCR法 第6部分:山药淀粉 1 范围 本文件规定了食用淀粉及其制品中山药植物源成分的实时荧光PCR鉴别方法。 本文件适用于食用淀粉及其制品中山药成分的定性检测。 本文件所规定方法的检出限(LOD)为1%(质量比)。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 12104 淀粉术语 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 GB/T 12104 界定的术语和定义适用于本文件。 4 方法提要 提取样品DNA,以山药DNA为阳性对照,以其他淀粉植物DNA为阴性对照,无菌水作为空白对 照,使用山药特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增,观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在 山药成分。 5 试剂和材料 5.1 检测用引物和探针 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682中一级水的规格。所 有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 山药成分扩增引物和探针、内参照引物和探针详见表1。山药引物扩增的靶标序列参见附录A。 1SN/T5522.6—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 表1 山药成分鉴定用引物和探针序列 名称 引物/探针序列(5’→3’) 扩增片段长度靶基因 内参照正向引物:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 反向引物:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 探针:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA137 bp18S rRNA 山药正向引物:GTTTCAAAGCCCTACGAGCC 反向引物:TGGGCCTTGGAAAGTTTTGG 探针:FAM-CGTCTGGAGGATCTGCGAAT-TAMAR77 bp rbcL 注: FAM和TAMAR可以用其他等效荧光基团替代。 5.2 三氯甲烷 (氯仿)。 5.3 异丙醇。 5.4 CTAB提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH 8.0。 5.5 CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。 5.6 70%乙醇 (体积分数)。 5.7 NaCl溶液 (1.2 mol/L)。 5.8 蛋白酶K (20 mg/mL)。 5.9 实时荧光PCR反应混合液(/12.5 μL):1 U~2 U(Unit,酶学单位) 的Taq酶、2×PCR buffer、 2.5 mmol/L~4.0 mmol/L的Mg2+、0.2 U~1 U的UNG酶、0.2 mmol/L的d (A,C,G) TPs、 0.2 mmol/L~0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/L ROX染料 (某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。 6 仪器设备 6.1 实时荧光PCR仪。 6.2 恒温水浴锅。 6.3 离心机:转速≥12 000 g。 6.4 微量移液器:0.5 μL~10 μL,10 μL~100 μL,20 μL~200 μL,200 μL~1 000 μL。 6.5 恒温混匀仪 6.6 涡旋震荡器。 6.7 pH计。 6.8 天平:感量0.01g。 7 检测步骤 7.1 DNA提取 将样品研磨至粉末(淀粉样品直接称取),取100 mg~200 mg于2 mL离心管中,加入1.5 mL CTAB裂解液和10 μL蛋白酶K溶液。65 ℃振荡2 h,12 000 g离心10 min,转移上清液至一洁净 2 mL离心管中。加入750 μL氯仿后涡旋振荡,12 000 g离心5 min,将上清转移到新的离心管中。加 入2倍体积的CTAB沉淀溶液,室温静置1 h,12 000 g离心15 min,弃去上清。加入350 μL 2SN/T5522.6—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 1.2 mol/L NaCl溶液将沉淀溶解,加入350 μL氯仿,涡旋振荡混匀,12 000 g离心10 min。转移上清 后加入0.8倍体积的异丙醇,混匀-20 ℃放置1 h,12 000 g离心10 min,弃去上清。加入500 μL 70% 乙醇溶液洗涤沉淀,溶解于100 μL 无菌水中,-20 ℃保存。 上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取。 7.2 实时荧光PCR扩增 7.2.1 实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系见表2。 表2 实时荧光PCR反应体系 试剂 体积 实时荧光PCR反应混合液 12.5 μL 正向引物 (10 μmol/L) 0.5 μL 反向引物 (10 μmol/L) 0.5 μL 探针 (10 μmol/L) 0.5 μL DNA模板 (5 ng/μL~20 ng/μL) 5.0 μL 灭菌ddH2O 6.0 μL 按照表2配制山药基因和内参照基因的反应体系。设置3个重复,以Ct值平均值作为最终结果。检 测过程中应分别设立阳性对照和阴性对照。 用含山药成分的样品DNA作阳性对照,不含山药成分的样品DNA作阴性对照。 7.2.2 实时荧光PCR反应程序 50℃ 2 min;95℃预变性 10 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,40个循环。 8 质量控制 8.1 DNA提取有效性判定 将含山药成分的样品、不含山药成分的样品和待测样品同步进行DNA的提取,使用内参照引物和 探针对三者进行检测,都有FAM荧光信号检出,且FAM通道均出现明显的扩增曲线,Ct值≤35.0,表 明三者DNA提取均有效。否则DNA提取无效,应重新提取DNA,直至Ct值≤35.0。 8.2 PCR有效性判定 空白对照:无FAM荧光信号,相应Ct值≥40.0。 阴性对照:无FAM荧光信号,相应Ct值≥40.0。 阳性对照:有FAM荧光信号,且FAM通道出现明显的扩增曲线,Ct值≤35.0。 否则判定为PCR无效。 9 结果判定 在符合8.1和8.2的情况下,使用山药特异性引物和探针对被检样品进行检测: 3SN/T5522.6—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝