̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.20 CCSB 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5551—2022 夜来香花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Telosma mosaic virus 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 夜来香花叶病毒检疫鉴定方法 SN/T 5551—2022 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 网址 www.customskb.com/book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1 字数29千字 2023年1月第一版 2023年1月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·918 定价18.00元̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福州市金山公园管理处、福建省农业科学院果树研究 所、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人:沈建国、刘向国、范婷婷、陈筱铁、谢丽雪、李韬、陈细红、高芳銮、李敏、张永江。 ⅠSN/T5551—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 夜来香花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了夜来香花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。 本文件适用于进出境植物及其产品中夜来香花叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 夜来香花叶病毒基本信息 中文名:夜来香花叶病毒 学名:Telosma mosaic virus,缩写:TeMV。 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员。 夜来香花叶病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附 录A。 5 原理 根据TeMV与抗体间的特异性反应,对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)和 免疫层析试纸条检测;根据TeMV的基因组特征,对样品进行检测;通过这些方法的有效组合,判定样 品是否携带TeMV。 6 仪器设备、用具及试剂 6.1 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平、酶标仪、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20 ℃低温冰箱、 -80 ℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工 作台等。 1SN/T5551—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.2 用具 各种量程的可调移液器(1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2 μL)、PCR反应管、离心管 (1.5 mL)、研钵等。 6.3 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。DAS-ELISA试剂 按照附录B执行、免疫层析试纸条试剂按照附录C执行、RT-PCR试剂按照附录D执行、实时荧光RT- PCR试剂按照附录E执行。 7 抽样和样品制备 7.1 抽样 有病毒危害症状的植物材料单独抽样,TeMV的危害症状描述参见附录A;无危害症状的植物材 料抽样方法按照SN/T 2122中的规定执行。 7.2 样品制备 分别按照有症状和无症状进行样品制备。有症状植株每株单独编号并采集症状部位制样;无症状 植株,5株为一组编号并混合制样。称取0.5 g~1.0 g待测样品按1∶10(质量∶体积)加入抽提缓冲 液,用研钵研磨成浆,4 ℃下10 000 g离心10 min,上清即为样品提取液,用于DAS-ELISA和免疫层析 试纸条检测;或称取0.1 g待测样品提取核酸后用于RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测。 8 检测与鉴定 8.1 DAS-ELISA DAS-ELISA具体方法按照附录B执行。 8.2 免疫层析试纸条 免疫层析试纸条具体方法按照附录C执行。 8.3 RT-PCR RT-PCR具体方法按照附录D执行。 8.4 实时荧光RT-PCR 实时荧光RT-PCR具体方法按照附录E执行。 8.5 序列测定与比对 PCR产物纯化后,进行克隆、测序,或者直接测序。利用NCBI网站上的BLAST软件把测序所得 到的核苷酸序列与已知的TeMV相应序列进行比对。 2SN/T5551—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 9 结果判定与记录 9.1 结果判定 样品检测时,检测结果判定按下述原则进行。 ———若样品经DAS-ELISA或免疫层析试纸条检测结果为阴性,且RT-PCR或实时荧光RT-PCR 检测结果为阴性,则判定样品不携带TeMV。 ———若样品经DAS-ELISA或免疫层析试纸条检测结果为阳性,且RT-PCR或实时荧光RT-PCR 检测结果为阳性,则判定样品携带TeMV,否则判定样品不携带TeMV。 ———若样品RT-PCR检测结果为阳性,且实时荧光RT-PCR检测结果为阳性,则判定样品携带 TeMV,否则判定样品不携带TeMV。 ———若样品RT-PCR检测结果为阳性,且序列测定结果经比对分析为TeMV,则判定样品携带 TeMV,否则判定样品不携带TeMV。 9.2 结果记录 记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA 检测结果应有酶联反应数值;免疫层析试纸条检测结果应有试纸条检测图片;RT-PCR检测结果应有电 泳图片;实时荧光RT-PCR检测结果应有实时荧光结果图片。 10 样品的保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20 ℃或-80 ℃冰箱中1年,并作好登记和标记工 作,以备复验、谈判和仲裁。保存期满后,应经灭活处理。 3SN/T5551—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 附 录 A (资料性) 夜来香花叶病毒的背景资料 A.1 寄主范围 已报道的自然寄主主要为西番莲 (P a s s ifl o r a e d u l i s) 、夜来香(T e l o s m a c o r d a t a ) 、广藿香(P og- o s t e m o n c a b l i n)等植物。 A.2 病害症状 侵染西番莲后能引起一系列症状 ,包括叶片花叶 、扭曲和果实斑驳 、变小等。 图A.1 T e MV侵染西番莲引起的症状 (谢丽雪拍摄 ) A.3 分布地区 泰国、越南和中国 (海南、福建、贵州、广西) 。 A.4 传播途径 通过汁液摩擦接种传播 。远距离通过带毒种苗传播 。 A.5 粒体形态 病毒粒体呈弯曲线状 ,长约7 5 0 n m,宽约1 2 n m。 4S N/T5 5 5 1—2 0 2 2