̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.20 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5554—2022 玉米矮花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Maize dwarf mosaic virus 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、中华人民共和国哈尔滨海关、中华人民共和国长春海 关、中华人民共和国湛江海关、浙江大学、中国农业科学研究院植物保护研究所。 本文件主要起草人:于翠、田沂民、刘洪义、李海滨、龙阳、刘丽玲、吴建祥、刘忠梅、周雪平。 ⅠSN/T5554—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 玉米矮花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了玉米矮花叶病毒的DAS-ELISA、RT-PCR检测、免疫电镜及鉴别寄主测定等检测和 鉴定方法。 本文件适用于进出境及田间监管期禾本科植物材料包括种子、种苗及其蚜虫等传毒介体携带的玉 米矮花叶病毒的检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 玉米矮花叶病毒基本信息 中文名:玉米矮花叶病毒。 英文名:Maize dwarf mosaic virus。 缩写:MDMV。 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒。 MDMV的其他信息见附录A。 5 原理 PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1 000 g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、冷冻离心机、 -80 ℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器、球磨仪、电子透射显微镜。 6 仪器、设施、用具和试剂 6.1 仪器 PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1 000 g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、冷冻离心机、 -80 ℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、漩涡振荡器、球磨仪、电子透射显微镜。 1SN/T5554—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.2 设施 隔离温室(10 ℃~30 ℃)。 6.3 用具 可调式微量移液器(2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL、5 000 μL)及相应的无RNA酶的吸头、 无RNA酶的离心管、PCR管和研钵等。 6.4 试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯。 血清检测试剂盒、液氮、植物总RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR检测试剂盒、琼脂糖、PBS缓冲 液等。血清学和分子生物学试剂配制按照附录B和附录C执行。 7 抽样和待检样品制备 7.1 抽样 抽样按照SN/T 2122的规定执行。 7.2 待检样品制备 7.2.1 种子类样品 若样品中存在畸形、不成熟的种子,则从中挑取出来单独作为一个样品进行检测;若无明显异常,则 随机取适量种子,研磨仪研磨成粉后,按照1∶10(质量:体积)加入抽提缓冲液(符合B.1.5)混合均匀, 3 000 g低速离心取100 μL上清液用于DAS-ELISA或核酸检测,或取约0.1 g干粉样品直接提 取RNA。 7.2.2 种苗类样品 对于有症状的种苗类样品单独检测,重点选取表现症状的幼嫩叶片;无症状样品至少选取20株的 幼嫩叶片进行混样检测。样品研磨后按照1∶10(质量:体积)加入提取缓冲液混合均匀,制备的汁液分 别盛装于1.5 mL离心管中,3 000 g低速离心后吸取上清液用于DAS-ELISA或核酸检测,或直接将叶 片利用液氮进行研磨,取约0.1 g干粉样品直接提取RNA。 8 检测与鉴定 8.1 检测鉴定流程 检测流程见图1,在检测过程中应设置合适的对照。当首次检出或某一地区首次发生时,应在分子 检测结果的基础上,进一步采用其他方法进行验证。 2SN/T5554—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 图1 MDMV检测鉴定流程图 8.2 双抗体酶联免疫吸附测定方法 (D A S - E L I S A ) 取7. 2中制备的待检样品用于血清学检测 。试验设置 2个阳性对照孔 、2个阴性对照孔 、2个空白 对照孔作为质量控制 ,并根据送检样品数量设置待检测样品孔数 ,要求每个待测样品至少设 2次重复。 具体检测步骤按照附录 B执行。 8.3 R T - P C R 检测 取7. 2中制备的待检样品上清液 1 0 0 μL或0. 1 g粉末用于植物总 RNA提取并进行 RT - P C R 检 测。试验用健康的植物组织作阴性对照 ,用受MDMV 侵染的植物样品作阳性对照 ,用灭菌双蒸水作空 白对照,每个反应体系设置两个平行 。具体操作按照附录 C执行。 8.4 免疫电镜 免疫电镜检测按照 S N/T 1 8 4 0中的方法进行观察 。 3S N/T5 5 5 4—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 8.5 鉴别寄主测定 在室温(20 ℃~25 ℃)条件下,栽种于隔离检疫温室中的玉米(Zea mays)、高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]、假高粱(Sorghum halepense)等鉴别寄主植物真叶长出后可作为指示植物用于摩擦接 种。对经DAS-ELISA或RT-PCR检测阳性的植株或种子,加入适量接种缓冲液研磨后接种指示植物。 接种7 d~10 d后,根据寄主植物产生的症状,判定是否接种成功。具体操作见附录D。 9 结果判定 样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行。 ———RT-PCR初步筛检,若检测结果为阴性,则判定样品不携带MDMV;若一对引物检测结果为阳 性,则采用产物序列测定分析或另一对引物再次检测,若验证结果为阳性,则判定样品携带 MDMV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带MDMV。 ———ELISA检测仅用于有明显症状的植株样品,若ELISA检测结果阳性,则还需RT-PCR进行复 验,若验证结果阳性,则判定样品携带MDMV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带MD- MV。 10 样品与记录结果保存 10.1 经检测确定携带玉米矮花叶病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥条 件下,其他病叶等样品保存在-20 ℃冰箱中,有条件的保存在-80 ℃冰箱中。做好登记和标记工作。 10.2 记录包括:样品来源,种类,取样人员,实验的时间、地点、方法和结果,检验检疫员的签字等。酶 联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的光密度OD值,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片,RT- PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析数据 4SN/T5554—2022