ICS65.120 CCSB46 中华人民共和国国家标准 GB/T21101—2025 代替GB/T21101—2007 饲料中猪源性成分的测定 Determinationofporcine-derivedmaterialinfeeds 2025-06-30发布 2026-01-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T21101—2007《动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法》,与 GB/T21101—2007相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 更改了适用范围和检出限(见第1章,2007年版的第1章); b) 删除了“聚合酶链式反应”术语和定义(见2007年版的3.1); c) 增加了缩略语(见第4章); d) 增加了实时荧光聚合酶链式反应法(见第5章); e) 更改了样品(见6.4,2007年版的第7章); f) 更改了结果判定与表述(见6.6,2007年版的第9章); g) 更改了实验室污染防治措施(见第7章,2007年版的第10章); h) 更改了废弃物处理(见第8章,2007年版的第11章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本文件起草单位:四川威尔检测技术股份有限公司、成都海关技术中心、成都农业科技职业学院、青 岛海关技术中心、深圳海关动植物检验检疫技术中心、大连海关技术中心。 本文件主要起草人:杨苗、杨欣怡、张婧、张凤枰、林华、肖贤、李建臻、卢加文、余姓鸿、张艳红、 陆丽华、雷慧、孙涛、阮周曦、陈溪、安微、郑晶、陈瑛琪、薛昌华、张倩、陈润江。 本文件及其所代替文件历次版本发布情况为: ———2007年首次发布为GB/T21101—2007; ———本次为第一次修订。 ⅠGB/T21101—2025 饲料中猪源性成分的测定 1 范围 本文件描述了饲料中猪源性成分的实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)和聚合酶链式反应 (PCR)定性检测方法。 本文件实时荧光PCR法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、复合预混合饲料、饲料原料和混 合型饲料添加剂中猪源性成分的定性检测,PCR法适用于动物源性饲料原料中猪源性成分的定性 检测。 本文件的检出限为0.1%。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.3—2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 GB/T27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对(basepair) Ct:循环阈值(cyclethreshold) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) Tris:三羟甲基氨基甲烷(trihydroxymethylaminomethane) 5 实时荧光PCR法 5.1 原理 根据猪β-actin基因的特异性序列设计引物和探针,采用实时荧光PCR技术进行扩增,依据扩增反 应中产生的荧光信号和Ct值实现对猪源性成分的定性检测。 1GB/T21101—2025 5.2 试剂或材料 5.2.1 除非另有规定外,仅使用分析纯试剂。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。 5.2.2 水:符合GB/T6682规定的一级水。 5.2.3 氢氧化钠溶液(10mol/L):称取400g氢氧化钠,加水定容至1000mL,混匀。 5.2.4 Tris-盐酸溶液(1mol/L):称取121.1gTris溶解于800mL水中,用盐酸调pH至8.0,加水定容 至1L,混匀。于103.4kPa、121℃灭菌20min,室温保存。 5.2.5 EDTA溶液(0.5mol/L):称取186.1gNa2EDTA·2H2O,溶解于800mL水中,于磁力搅拌器 上剧烈搅拌,加入约20g氢氧化钠,再滴加氢氧化钠溶液(5.2.3)调pH至8.0,定容至1000mL,混 匀,于103.4kPa、121℃灭菌20min,室温保存。 5.2.6 Tris-EDTA缓冲液:分别量取10mLTris-盐酸溶液(5.2.4)和2mLEDTA溶液(5.2.5),加水定 容至1000mL,混匀,于103.4kPa、121℃灭菌20min,备用。 5.2.7 2×实时荧光PCR预混液。 5.2.8 引物和探针:用水将每条引物或者探针分别配制成100μmol/L储存溶液,备用,-18℃以下分 装保存,避免多次冻融。序列见表1。 5.2.9 阳性对照样品:含有猪源成分的样品。 5.2.10 阴性对照样品:不含有猪源成分但含有其他动物成分的样品。 表1 引物探针序列 目标物种 名称 序列 基因序列号片段大小 18SrRNA 基因 (内参对照)18S-179bp-F 18S-179bp-R 18S-179bp-P5'-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3' 5'-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3' 5'-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3'AF176811.1179bp 猪Porcine-97bp-F Porcine-97bp-R Porcine-97bp-P5'-CGTAGGTGCACAGTAGGTCTGAC-3' 5'-GGCCAGACTGGGGACATG-3' 5'-[FAM]-CCAGGTCGGGGAGTC-[NFQ-MGB]-3'DQ452569.197bp 注:扩增靶标序列见附录A。 5.3 仪器设备 5.3.1 实时荧光PCR仪。 5.3.2 分析天平:精度0.1mg。 5.3.3 离心机:离心速度不低于14000r/min。 5.3.4 紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪。 5.3.5 微量移液器:2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等规格。 5.4 样品 按照GB/T20195规定制备试样,至少200g,粉碎或研磨使其全部通过0.25mm孔径的试验筛,充 分混匀,装入密闭容器中,备用。 同法制备阳性对照样品(5.2.9)和阴性对照样品(5.2.10)。 注:粉碎或研磨一个样品后,清洗粉碎机或研磨仪的容器和刀具,防止污染。 2GB/T21101—2025 5.5 试验步骤 5.5.1 DNA提取 平行做两份试验。称取试样100mg~200mg(精确至0.1mg),按照GB/T19495.3—2004附录C 中C.6.2提取DNA。提取空白对照除不加试样外,其他操作同试样一致。必要时,提取阳性对照样品 和阴性对照样品的DNA。也可采用经过验证可靠的DNA提取试剂盒,具体参考说明书使用。提取的 DNA如需保存,置于-18℃以下。 5.5.2 DNA溶液浓度测定 用紫外分光光度计(波长:260nm)或微量核酸蛋白测定仪(5.3.4)测定按5.5.1提取的DNA溶液的 质量浓度。DNA溶液质量浓度宜为5ng/μL~50ng/μL。 5.5.3 对照设置 实时荧光检测过程中应设置阳性对照、阴性对照、扩增空白对照、按5.5.1提取的空白对照。用阳 性对照样品(5.2.9)的DNA作阳性对照,用阴性对照样品(5.2.10)的DNA作阴性对照,用等体积的水 代替DNA溶液作为扩增空白对照。 5.5.4 反应体系 按表2配制实时荧光PCR检测反应体系。 表2 实时荧光PCR实验反应体系 试剂 工作液浓度 体积 实时荧光PCR试剂 2× 12.5μL 上游引物 10μmol/L 1μL 下游引物 10μmol/L 1μL 探针 10μmol/L 0.5μL DNA溶液 5ng/μL~50ng/μL 5μL 水 — 5μL 5.5.5 实时荧光PCR扩增 按表3反应参数在实时荧光PCR仪上进行扩增,以平行测定的Ct值的平均值作为最终结果。 表3 实时荧光PCR反应参数 反应步骤 反应温度 反应时间 循环数 预变性 95℃ 10min 1 热循环95℃ 60℃15s 1min40 3GB/T21101—2025 5.6 质量控制 5.6.1 内参对照基因扩增 真核生物内参对照基因18SrRNA基因检测应符合下列条件,否则重新提取核酸样品。 a) 提取空白对照:Ct值≥37.0或无Ct值。 b) 扩增空白对照:Ct值≥37.0或无Ct值。 c) 阴性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤28.0。 d) 阳性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤28.0。 e) 待测样品:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤33.0。 5.6.2 猪源性特异基因扩增 猪源性特异基因的实时荧光PCR检测应符合以下条件: a) 提取空白对照:Ct值=40.0或无Ct值; b) 扩增空白对照:Ct值=40.0或无Ct值; c) 阴性对照:荧光通道无荧光信号检出,Ct值