Q/LB.□XXXXX-XXXX ICS 65.140 CCS B47 中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准 GH/T 1312—2020 GH 蜂胶中绿原酸、咖啡酸、p-香豆酸、3,5- 二咖啡酰奎宁酸、 4,5-二咖啡酰奎宁酸和阿 替匹林 C 的测定 高效液相色谱法 The determination of chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid and artepillin C in propolis — High performance liquid chromatography 2020 - 12 - 07发布 2021 - 03 - 01实施 中华全国供销合作总社 发 布 GH/T 1312-2020 I 目 次 前言 ................................................................................ II 引言 ............................................................................... III 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 试剂与材料 ........................................................................ 1 6 仪器和设备 ........................................................................ 2 7 试样制备与保存 .................................................................... 2 8 操作步骤 .......................................................................... 2 9 结果计算与表示 .................................................................... 3 10 灵敏度 ........................................................................... 3 11 精密度 ............................................................................ 4 附录 A（规范性） 高效液相色谱梯度洗脱条件 ............................................ 5 附录B（资料性） 标准品混合液、酒神菊属型蜂胶 ......................................... 6 GH/T 1312-2020 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由中华全国供销合作总社提出。 本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口。 本文件起草单位：浙江大学、杭州蜂情科技有限公司、蜂乃宝本铺（南京）保健食品有限公司、 江山福赐德蜂业科技开发有限公司、厦门思健生物科技有限公司、长兴意蜂蜂业科技有限公司。 本文件主要起草人：胡福良、张翠平、柳刚、刘嘉、徐水荣、颜鉴翔、邱汝民。 GH/T 1312-2020 III 引 言 本文件的发布机构提请注意， 声明符合本文件时， 涉及到本文件相关的专利 （ ZL 201610279885.2 ） 的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件 下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通 过以下联系方式获得： 专利持有人：浙江大学、蜂乃宝本铺（南京）保健食品有限公司。 地址：浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些 专利的责任。 GH/T 1312-2020 1 蜂胶中绿原酸、咖啡酸、 p-香豆酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二 咖啡酰奎宁酸和阿替匹林 C的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了高效液相色谱法测定蜂胶中绿原酸、咖啡酸、 p-香豆酸、 3,5-二咖啡酰奎宁酸、 4,5-二 咖啡酰奎宁酸和阿替匹林 C的方法。 本文件适用于蜂胶中绿原酸、咖啡酸、 p-香豆酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸和阿 替匹林C的定量测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蜂胶 propolis 工蜂采集树脂等植物分泌物与其上颚腺、蜡腺分泌物等混合形成的胶粘性物质。 4 原理 试样经85%乙醇超声提取、离心、过滤，用高效液相色谱仪经紫外检测器在 280 nm处检测绿原酸、 咖啡酸、 p-香豆酸、 3,5-二咖啡酰奎宁酸、4 ,5-二咖啡酰奎宁酸和阿替匹林 C，外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有规定，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定要求。 5.1 甲醇：色谱纯。 5.2 无水乙醇。 5.3 乙酸：色谱纯。 GH/T 1312-2020 2 5.4 0.1%乙酸溶液：量取 1 mL乙酸（5.3）加入1000 mL水中充分混匀，备用。 5.5 绿原酸： CAS号为327-97-9，纯度≥ 95%；咖啡酸： CAS号为331-39-5，纯度≥ 98%；p-香豆酸： CAS号为501-98-4，纯度≥ 98%；3,5-二咖啡酰奎宁酸： CAS号为2450-53-5, 纯度≥98%；4,5-二咖啡酰 奎宁酸： CAS号为32451-88-0, 纯度≥98%；阿替匹林 C：CAS号为72944-19-5 ，纯度≥ 98%。 5.6 标准储备溶液：准确称取适量的每种标准物质（ 5.5），分别用甲醇（ 5.1）配制浓度为 2 mg/mL 标准储备溶液，于 -18℃冰箱保存，可保存 6个月。 5.7 混合标准储备溶液： 分别准确移取适量的标准储备溶液 （ 5.6） ， 用甲醇配制成混合标准工作溶液， 其中各被测物浓度分别是 : 绿原酸 0.1 mg/mL 、咖啡酸 0.1 mg/mL 、p-香豆酸 0.2 mg/mL 、3,5-二咖啡酰 奎宁酸 0.2 mg/mL 、4,5-二咖啡酰奎宁酸 0.2 mg/mL 、阿替匹林 C 1.0 mg/mL 。 5.8 混合标准工作溶液：准确移取适量的混合标准储备溶液（ 5.7），用甲醇配制混合标准工作溶液， 并依次稀释得到 6个不同浓度梯度的混合标准溶液（绿原酸 0.01~0.1 mg/mL 、咖啡酸 0.01~0.1 mg/mL 、 p-香豆酸 0.02~0.2 mg/mL 、3,5-二咖啡酰奎宁酸 0.02~0.2 mg/mL 、4,5-二咖啡酰奎宁酸 0.02~0.2 mg/mL 、 阿替匹林 C 0.1~1.0 mg/mL ），现用现配。 5.9 滤膜：0.45 μm。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器。 6.2 粉碎机。 6.3 超声波清洗器。 6.4 离心机。 6.5 天平：感量 0.001 g。 6.6 分析天平：感量 0.00001 g 。 7 试样制备与保存 从待测蜂胶样品中取出约 100 g，密封，并做标记，于 -18 ℃冷冻保存。 取出冷冻贮存的试样 20 g～30 g，迅速用粉碎机粉碎，过 40目筛。 8 操作步骤 8.1 试样溶液的制备 GH/T 1312-202