ICS 67.180.10 CCS X31 中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准 GH/T 1315—2020 GH 蜂蜜中酪蛋白的测定 酶联免疫法 Determination of casein in honey— Enzyme-linked immunosorbent assay method 2020 - 12 - 07 发布 2021 - 03 - 01 实施 中华全国供销合作总社 发 布 GH/T 1315 —2020 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华全国供销合作总社提出。 本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口。 本文件起草单位：秦皇岛海关技术中心、上海冠生园蜂制品有限公司。 本文件主要起草人：王海洋、柳吉芹、高飞、钱云开、崔宗岩、张昂、张进杰、吴曦、王立杉、李 亮、孙萍。 GH/T 1315 —2020 2 蜂蜜中酪蛋白的测定 酶联免疫法 1 范围 本文件规定了蜂蜜中酪蛋白的酶联免疫测定方法。 本文件适用于洋槐蜜、油菜蜜、椴树蜜、荆条蜜中酪蛋白的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 样品中的酪蛋白与微孔板包被的特异性抗体结合，形成抗体 -抗原复合物。洗板后加入酶标抗体， 形成抗体 -抗原-酶标抗体复合物（ “三明治”夹心法） 。然后加入底物显色，用酶标仪测定 450 nm处的吸 光度值，根据吸光度值得出样品中酪蛋白的含量，吸光度值与样品中的酪蛋白含量成正比。 5 试剂和材料 5.1 水 按照GB/T 6682 规定的一级水。 5.2 酪蛋白酶联免疫测定试剂盒 商品化试剂盒 （ RIDASCREEN®FAST Casein ）1）： 包括48孔微孔板、 酪蛋白标准品 0 µg/mL、0.5 µg/mL 、 1.5 µg/mL 、4.5 µg/mL 、13.5 µg/mL 、底物/发色剂、终止液、酶标抗体稀释缓冲液、 11x酶标抗体（使 用前按体积比例 1:11用酶标抗体稀释缓冲液稀释） 、 10x样品提取缓冲液（使用前按比例 1:10用蒸馏水 稀释） 、10x洗涤缓冲液（使用前按比例 1:10用蒸馏水稀释） 。 6 仪器和设备 6.1 水浴锅：温度 60 °C±1 °C 。 6.2 冷冻离心机：最大离心力大于或等于 3000 g，4 °C。 1）给出该信息是为了方便本文件使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其它产品的操作步骤有不同，须 经试验评估后采用。 GH/T 1315 —2020 3 6.3 酶标仪：测量波长 450 nm。 6.4 振荡器：震荡频率大于或等于 100 次/min。 6.5 电子天平：感量 0.01 g。 6.6 微量可调单通道移液器：量程 20 µL～200 µL，100 µL～1000 µL。 6.7 微量可调 8通道移液器：量程 30 µL～300 µL。 6.8 离心管： 1.5 mL，50 mL。 7 样品制备与保存 7.1 样品制备 对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过 60 °C的水浴 中温热， 待样品全部融化后搅匀， 冷却至室温。 分出 100 g作为测定试样。 制备好的试样置于样品瓶中， 密封，并做上标记。 7.2 样品保存 将试样于常温下保存。 8 测定步骤 8.1 样品提取 称取1 g 蜂蜜样品， 精确至 0.01 g， 置于50 mL离心管中， 加入 19 mL样品提取缓冲液 （ 60 °C预热） ， 充分混匀。 60 °C水浴提取 10分钟，提取过程振荡混匀 2-3次。快速冷却样品， 4 °C，3000 g离心10 min。 取200 μL上清液置于 1.5 mL离心管中，加入 400 μL样品提取缓冲液，混合均匀（样品 3倍稀释）。取 100 μL混合液进行测定。 8.2 测定条件 8.2.1 所有操作应在室温下（ 20 °C～25 °C）进行，所有试剂均应回温至室温（ 20 °C～25 °C）方可使 用。 8.2.2 取出测定需用的微孔板条插入微孔架上，记录标准品及样品在微孔架上的位置（每个样品 2个平 行）。 8.3 酶联免疫试剂盒测定 8.3.1 加样：每孔加入 100 µL标准品及样品，在室温条件下（ 20 °C～25 °C）孵育10 min。 8.3.2 洗涤：倒出孔中的液体，反扣在吸水纸上反复拍打，每孔加入 250 µL洗涤缓冲液洗板，重复 3次。 8.3.3 加酶标抗体：每孔加入 100 µL酶标抗体溶液，充分混合，在室温条件下（ 20 °C～25 °C）孵育10 min。 8.3.4 洗涤：按 8.3.2洗板3次。 8.3.5 显色： 每孔加入 100 µL底物/发色剂， 充分混合后在室温 （ 20 °C～25 °C） 条件下避光孵育 10 min。 8.3.6 测定：每孔加入 100 µL反应终止液，充分混合。 10 min内于酶标仪 450 nm处测量吸光度值。 9 结果计算 分别计算标准品和样品的平均吸光度值。 以标准品浓度的对数值（ lg）为横坐标，以平均吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。从标准曲线上得 到试样中相应的酪蛋白含量（ c）后，结果按式（ 1）计算： GH/T 1315 —2020 4 X = c × f × V × 1000 m × 1000⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ （1） 式中： X — 样品中酪蛋白含量，单位为毫克每千克（ mg/kg）； c — 从标准曲线上得到的试样中酪蛋白含量，单位为微克每毫升（ µg/mL）； f — 样品稀释倍数； V— 样品的最终定容体积（ mL）； m— 样品质量（ g）； 计算结果精确至小数点后两位。 10 测定方法灵敏度、准确度、精密度 10.1 灵敏度 本方法的定量限为 1.5 mg/kg 。 10.2 准确度 本方法在 1.5 mg/kg ～40.5 mg/kg 添加水平上的回收率为 70%～120%。 10.3 精密度 平行测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的 20%。