ICS 67.180.10 CCS X31 中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准 GH/T 1356—2021 GH 枇杷蜜植物源成分的检测 实时荧光 PCR法 Identification of Loquat Species in Loquat Honey — Real-time PCR Method 2021 - 11 - 08发布 2022 - 01 - 01实施 中华全国供销合作总社 发 布 GH/T 1356 —2021 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华全国供销合作总社提出。 本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口。 本文件起草单位：中国计量大学、中国农业科学院蜜蜂研究所、安徽中杰检测技术有限公司、中国 蜂产品协会、金华市农业科学研究院、杭州余杭归蜜家庭农场、蜜中情（杭州）蜂业科技有限公司。 本文件主要起草人：李红亮、王秀红、谭丽蕊、苏晓玲、吴帆、杨雪梅、张籍、季连光、于浩。 GH/T 1356 —2021 1 枇杷蜜植物源成分的检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件规定了枇杷蜜中植物源成分的实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于以枇杷作为蜜源的蜂蜜中特有枇杷植物源成分的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 枇杷 Loquat tree 枇杷（Rhaphiolepis bibas L.）（原 Eriobotrya japonica L.），蔷薇科、石斑木属（原枇杷属） 植物。 3.2 枇杷蜜 Loquat honey 蜜蜂采集枇杷的花蜜，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。 3.3 实时荧光 PCR real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板 的定量及定性分析。 3.4 循环阈值 C ycle threshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid) GH/T 1356 —2021 2 PCR：聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction) qPCR：定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chain reaction) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide) OD260/280：260nm/280nm下的光密度值(Optical Density) Ct 值：循环阈值(Cycle threshold) FAM：羧基荧光素(Carboxyfluorescein) TAMRA：羧基四甲基罗丹明(Carboxy-tetramethyl-rhodamine) 5 原理 从枇杷蜜中分离枇杷植物源成分并提取其 DNA，进行实时荧光 qPCR 反应。通过荧光信号是否 对数增长而判断扩增是否成功，再通过扩增获得的Ct 值大小，判定是否含有枇杷植物源成分。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 扩增仪 6.2 高速冷冻离心机 6.3 超微量紫外可见分光光度计 6.4 恒温水浴锅 6.5 分析天平：感量 0.1 mg。 6.6 微量移液器：量程 0.1 µL－2.5 µL, 0.5 µL－10 µL，2 µL－20 µL，20 µL－200 µL, 200 µL －1000 µL。 7 试剂和材料 7.1 引物 7.1.1 上游引物 F：5’-GCCCGGCGTCCCCTTATC-3’ 7.1.2 下游引物 R：5’-ATCGCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3’ 7.1.3 荧光探针 P：FAM-5’-CGTATTGCGCCAAGGAACTCGAACGAAAGAG-3’-TAMRA 7.2 对照样品 7.2.1 阴性对照：非枇杷植物 DNA（如油菜、党参、茶等）。 7.2.2 阳性对照：枇杷叶。 7.2.3 空白对照：实时 qPCR 反应时以水代替扩增 DNA模板。 7.3 试剂 除非另有规定，本文件中所用试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 一级水的规定。 7.3.1 适合荧光探针法的 qPCR反应试剂(2×)， GH/T 1356 —2021 3 7.3.2 实时荧光 qPCR专用参比染料(50×) 7.3.3 CTAB裂解缓冲液（配制方法见附录 A.1） 7.3.4 提取缓冲液（配制方法见附录 A.2） 7.3.5 亚硫酸氢钠（Sodium disulphite） 7.3.6 聚乙烯吡咯烷酮-40（PVP-40） 7.3.7 5%十二烷基肌氨酸钠（配制方法见附录 A.3） 7.3.8 氯仿/异戊醇（体积比 24:1） 7.3.9 异丙醇（-20℃预冷） 7.3.10 70% 乙醇 8 操作程序 8.1 提取工作液 各取41.7 mL CTAB裂解缓冲液(7.3.3)和提取缓冲液(7.3.4)， 再依次加入0.5 g亚硫酸氢钠(7.3.5) 和 2 g 聚乙烯吡咯烷酮-40(7.3.6)，充分振荡混匀，加入 5%十二烷基肌氨酸钠（约 16 mL）(7.3.7)， 制成 100 mL 提取工作液。工作液需现用现配。 8.2 样品处理和 DNA提取 8.2.1 称取 25 g蜂蜜样品，与30 mL无菌水混合，振荡混匀。8000 r/min 离心 25 min。 8.2.2 弃上清液,将沉淀溶解于1 mL 现配的提取工作液(8.1)中。充分混匀后，于 37 ℃水浴过夜。 8.2.3 次日，向样品中加入等体积氯仿/异戊醇（体积比 24∶1）(7.3.8)，缓慢颠倒混匀 30 min，4000 r/min离心20 min。 8.2.4 转移上清至新离心管中，加入等体积 4℃预冷的异丙醇(7.3.9)。4000 r/min 离心30 min。 8.2.5 弃上清，DNA 位于沉淀中，样品中加入 70%乙醇(7.3.10)溶液反复吹打洗涤。 8.2.6 离心后弃去乙醇， 室温或 37℃烘干至乙醇完全挥发， 加 25 μL H 2O 溶解 DNA， 于–20 °C保存。 8.3 提取 DNA 的浓度和 OD 260/280测定 吸取 1 μL提取的 DNA 样品(8.2.6)， 利用超微量紫外可见分光光度计测定提取 DNA样品的浓度(单 位为 ng/µL)和 OD 260/280数值(理想值应为 1.8 左右)，DNA 稀释到 10 ng/ μL 备用。 8.4 实时荧光 PCR 反应 8.4.1 实时荧光 PCR 反应体系 实时荧光PCR反应体系按表1规定配制，每个样品和参照重复扩增2次，Ct值取平均值。配制反应液 时尽量避光且避免产生气泡。 GH/T 1356 —2021 4 表 1 实时荧光 PCR反应体系配制表 体系组分 用量 终浓度 实时荧光 PCR反应液 适合荧光探针法的qPCR反应试剂(2×) 10.0 μL ddH2O 6.0 μL 上游引物F(10 μM) 0.4 μL 0.2 μmol/L 下游引物R(10 μM) 0.4 μL 0.2 μmol/L 荧光探针P(10 μM) 0.8 μL 0.4 μmol/L ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL 样品 DNA(100.0 ng/μL) 2.0 μL 10.0 ng/μL 总量 20 μL 8.4.2 实时荧光 PCR 反应参数和条件 95 ℃预变性 20 s，然后 95℃ 3s、60℃ 30s，45个循环。反应参数和条件仅供参考，具体可根据 所用探针法 qPCR 试剂和实时荧光 PCR仪操作说明书设置。 9 质量控制 以下条件有一条不满足时，实验视为无效： a) 阳性对照：应有荧光对数增长，并出现典型的扩增曲线，Ct 值≤30。 b) 阴性对照：应无荧光对数增长或典型的扩增曲线，或相应的 Ct值＞40。 c) 空白对照：应无荧光对数增长或典型的扩增曲线，或相应的 Ct值＞40。 10 结果判断与表述 10.1 结果判定 在符合第 9步的情况下，结果判定如下： a) Ct值≤37，则判定为阳性。 b) Ct值≥40 或无荧光对数增长或典型扩增曲线，则判定为阴性。 c) 37＜Ct 值＜40，则重复实验一次。再次扩增后Ct 值＜40，则判定为阳性；Ct 值≥40，则判定 为阴性。 10.2 结果表述 10.2.1 DNA 提取(8.3)浓度＜5.0 ng/μL，表述为“未提取到有效的植物 DNA 组分”。 10.2.2 目标成分阳性，表述为“检出枇