书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜４ ５ １ ９—２ ０ １ ６ 出口动物源食品中利巴韦林残留量的测定　液相色谱 质谱／质谱法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狉 犻 犫 犪 狏 犻 狉 犻 狀狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 犻 狀犳 狅 狅 犱 狊 狋 狌 犳 犳 狊狅 犳犪 狀 犻 犿 犪 犾狅 狉 犻 犵犻 狀犳 狅 狉犲 狓 狆狅 狉 狋—犔 犆  犕 犛／犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱 ２ ０ １ ６０ ６２ ８发布 ２ ０ １ ７０ ２０ １实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。本标准起草单位 ：中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、中华人民共和国东山出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、中华人民共和国绍兴出入境检验检疫局 、福建圣农发展股份有限公司 。本标准主要起草人 ：刘正才、杨方、潘迎芬、林永辉、陈旭东、徐敦明、任明兴、吕小玲。 Ⅰ犛 犖／犜４ ５ １ ９—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.出口动物源食品中利巴韦林残留量的测定　液相色谱 质谱／质谱法 １　范围 本标准规定了动物源食品中利巴韦林残留量的液相色谱 质谱／质谱的测定方法 。本标准适用于鸡肉 、肝脏、肾、蛋、猪肉、鳗鱼、虾等动物源食品中利巴韦林残留量的测定和确证 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　方法提要 试样中残留的利巴韦林代谢物经酸性磷酸酯酶水解成利巴韦林原药 ，与样品中残留的利巴韦林原药一起，经三氯乙酸 乙晴混合溶液提取 ，经苯硼酸固相萃取小柱净化 ，液相色谱 质谱／质谱进行测定 ，同位素内标法定量 。 ４　试剂和材料 除非另有说明 ，所用试剂均为分析纯 ，水为Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２规定的一级水 。 ４．１　甲醇：色谱纯。 ４．２　乙腈：色谱纯。 ４．３　甲酸：色谱纯。 ４．４　三氯乙酸 。 ４．５　氨水：含量为２ ５％～２ ８％。 ４．６　乙酸铵：色谱级纯 。 ４．７　酸性磷酸酯酶 （ｐｈ ｏ ｓｐｈ ａ ｔ ａ ｓ ｅａ ｃ ｉ ｄ ，ｆ ｒ ｏ ｍｗ ｈ ｅ ａ ｔ ｇｅ ｒ ｍ，活力：≥０． ４ｕ ｎ ｉ ｔ／ｍｇ，ＣＡ Ｓ号：９ ０ ０ １  ７ ７  ８ ） 。 ４．８　酸性磷酸酯酶溶液 （１ ０ ０μｇ／ｍＬ） ：准确称取酸性磷酸酯酶 （４． ７）５ｍｇ，置５ ０ｍＬ容量瓶中 ，用水溶解并稀释至刻度 ，摇匀，配制成１ ０ ０μｇ／ｍＬ的酶解液 ，４℃～８℃冰箱中保存 。 ４．９　三氯乙酸溶液 （２ ０ｇ／Ｌ，ｐＨ４． ８） ：称取２ ０ｇ三氯乙酸 ，加水约９ ５ ０ｍＬ 使其溶解 ，用氨水调 ｐＨ至 ４． ８（±０． １） ，再加水定容至 １０ ０ ０ｍＬ 。 ４．１ ０　Ｐ Ｂ Ａ苯硼酸固相萃取小柱洗脱液 ，甲酸水甲醇溶液 （体积比２∶８∶９ ０ ） ：准确量取 ２ｍＬ甲酸和 ８ｍＬ水加入９ ０ｍＬ的甲醇中 ，混匀后备用 。 ４．１ １　乙酸铵缓冲溶液 （２． ０ｍ ｏ ｌ／Ｌ，ｐＨ４． ８） ：称取乙酸铵 ７ ７． ０ｇ，加水约４ ５ ０ｍＬ 使其溶解 ，用乙酸调 ｐＨ至４． ８（±０． １） ，再加水定溶至 ５ ０ ０ｍＬ 。 ４．１ ２　乙酸铵缓冲溶液 （０． ２ ５ｍ ｏ ｌ ／Ｌ，ｐＨ８． ５） ：称取乙酸铵 ９． ０ ６ｇ，加水约４ ５ ０ｍＬ 使其溶解 ，用氨水调 ｐＨ至８． ５（±０． １） ，再加水定容至 ５ ０ ０ｍＬ 。 １犛 犖／犜４ ５ １ ９—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４．１ ３　标准物质 ：利巴韦林 （ｒ ｉ ｂ ａ ｖ ｉ ｒ ｉ ｎ ；ＣＡ Ｓ号：３ ６ ７ ９ １  ０ ４  ５ ） ，纯度大于 ９ ８． ０％。 ４．１ ４　同位素内标标准物质 ：利巴韦林 １ ３Ｃ５纯度大于 ９ ９． ０％。 ４．１ ５　标准储备液 （１ ０ ０μｇ／ｍＬ） ：准确称取利巴韦林标准品 （４． １ ３）１ ０ｍｇ（精确至０． １ｍｇ） ，置１ ０ ０ｍＬ 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度 ，摇匀，配制成１ ０ ０μｇ／ｍＬ的标准储备液 ，－１ ８℃冰箱中保存 ，有效期为１年。 ４．１ ６　标准中间液 （１． ０μｇ／ｍＬ） ：用移液管吸取标准储备液 （４． １ ５）１ｍＬ置１ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，用甲醇稀释至刻度 ，摇匀得到 １． ０μｇ／ｍＬ标准中间液 ，置４℃～８℃冰箱中保存 ，有效期为 ３个月。 ４．１ ７　内标储备液 ：准确称取利巴韦林 １ ３Ｃ５标准品（４． １ ４）１ ０ｍｇ（精确至０． １ｍｇ） ，置１ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ， 用甲醇溶解并稀释至刻度 ，摇匀，配制成１０ ０μｇ／ｍＬ的内标标准储备液 ，－１ ８℃冰箱中保存 ，有效期为 １年。 ４．１ ８　内标中间溶液 （１． ０μｇ／ｍＬ） ：移取１． ０ ０ｍＬ 的内标标准储备液 （４． １ ７）至１ ０ ０ｍＬ 容量瓶中 ，用甲醇稀释至刻度 ，置４℃～８℃冰箱中保存 ，有效期为 ３个月。 ４．１ ９　标准工作液 ：临用时根据需要 ，移取适量的标准中间溶液 （４． １ ６）和内标中间溶液 （４． １ ８） ，用乙腈稀释至合适浓度 ，使用前配制 。 ４．２ ０　Ｐ Ｂ Ａ苯硼酸固相萃取小柱 ：１ ０ ０ｍｇ／３ｍＬ，或相当者 ；使用前依次用 ３ｍＬ乙腈，３ｍＬ乙腈 １％甲酸（体积比，３∶１） ，３ｍＬ乙酸铵缓冲溶液 （４． １ ２）活化，并保持柱体湿润 。 注：可采用商品化的 Ｂ ｏ ｎ ｄＥ ｌ ｕ ｔＰ Ｂ Ａ 固相萃取小柱 ［Ｂ ｏ ｎ ｄＥ ｌ ｕ ｔＰ Ｂ Ａ ，ｐａ ｒ ｔＮ ｏ：１ ２ １ ０ ２ １ ２ ７ ，Ｕ Ｓ Ａ］ ，或等同性能的其他 小柱。 ４．２ １　滤膜：０． ２ ２μｍ，有机系。 ５　仪器和设备 ５．１　液相色谱 质谱／质谱仪：配电喷雾电离 （Ｅ Ｓ Ｉ）源。 ５．２　天平：感量０． １ｍｇ和０． ０ １ｇ。 ５．３　组织捣碎机 。 ５．４　高速冷冻离心机 ：转速≥８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ。 ５．５　离心机：５０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ。 ５．６　漩涡振荡器 。 ５．７　ｐＨ计。 ５．８　氮吹仪。 ５．９　固相萃取装置 。 ６　试样制备与保存 ６．１　试样制备 肌肉、肝脏、肾放入组织捣碎机均质 ，充分混匀 ，均分成两份 ，分别装入清洁容器内 ，并标明标记 ；蛋 类，虾去壳后取可食部分后放入组织捣碎机均质 ，充分混匀 ，均分成两份 ，分别装入清洁容器内 ，并标明标记。制样操作过程中 ，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 。 ６．２　试样保存 试样于－１ ８℃以下保存 ，新鲜或冷冻的组织样品可在 ２℃～６℃贮存７ ２ｈ。 ２犛 犖／犜４ ５ １ ９—２ ０ １ ６ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.７　测定步骤 ７．１　提取 称取约５ｇ（精确至０． ０ １ｇ）试样，置于５ ０ｍＬ具螺旋盖的聚丙烯离心管中 ，添加１ ０ ０μＬ内标标准工作溶液（０． １μｇ／ｍＬ） ，加入１ ２ｍＬ三氯乙酸溶液 （４． ９）和２． ５ｍＬ 乙腈，振荡混匀 ３． ０ｍ ｉ ｎ 后在超声波发生器中超声 １ ０ｍ ｉ ｎ，于１ ５０ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ离心５ｍ ｉ ｎ，取出上清液 ，再加入１ ０ｍＬ三氯乙酸溶液 （４． ９）重复提取一次，离心后合并上清液定容至 ２ ５ｍＬ的容量瓶中 。 ７．２　酶解 准确移取 ５ｍＬ以上提取液 ，加入１． ０ｍＬ 乙酸铵溶液 （４． １ １） ，混匀，再加入１ ０ ０μＬ酸性磷酸酯酶 （４． ８） ，加盖后涡旋 １ｍ ｉ ｎ，于恒温烘箱中 ３ ７ ℃培养２ｈ。取出后冷却至室温 ，用氨水调 ｐＨ至８． ５（±０． １） ，混匀，４０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ离心５ｍ ｉ ｎ，取上清液备用 。 ７．３　净化 取上清液 （７． ２） ，上样到活化过的 Ｐ Ｂ Ａ固相萃取小柱 ，控制上样流速小于 ３ｍＬ／ｍ ｉ ｎ；依次用５ｍＬ含有１ ０％乙腈乙酸铵缓冲溶液 （４． １ ２）和２． ０ｍＬ５％ 氨水甲醇淋洗 ，然后真空抽干 ５ｍ ｉ ｎ，以４． ０ｍＬ 洗脱溶液（４． １ ０）洗脱至１ ０ｍＬ玻璃管中 ，在４ ５℃用氮气浓缩仪吹干 。准确加入 １． ０ｍＬ 乙腈水（体积比 ９ ０∶１ ０）溶液溶解残渣 ，过０． ２ ２μｍ滤膜，供液相色谱 质谱／质谱仪测定 。 ７．４　测定 ７．４．１　液相色谱条件 ７．４．１．１　色谱柱：两性离子型亲水相互作用色谱柱 ，１ ０ ０ｍｍ×３． ０ｍｍ （内径） ，粒度２． ７μｍ，或相当者 。 ７．４．１．２　流动相：Ａ为５ｍｍ ｏ ｌ／Ｌ乙酸铵溶液 （含０． ２％甲酸） ，Ｂ为乙腈，梯度洗脱 ，洗脱程序见表 １。 表１　液相色谱的梯度洗脱程序 时间／ｍ ｉ ｎ 流动相Ａ／％ 流动相Ｂ／％ ０ ５