以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5334.6 —2020 转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 6 部分：转基因马铃薯 Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived products — Part 6: Genetically modified potato 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5334.6—2020前 言 SN/T 5334— 2020《转基因植物产品的数字 PCR 检测方法》分为 8 个部分： ——第 1 部分：通用要求及定义；——第 2 部分：转基因大豆；——第 3 部分：转基因玉米；——第 4 部分：转基因油菜；——第 5 部分：转基因棉花；——第 6 部分：转基因马铃薯； ——第 7 部分：转基因苜蓿； ——第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T 5334— 2020 的第 6 部分。本文件按照 GB/T1.1— 2020 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国青岛海关技术中心，中华人民共 和国大连海关技术中心、中华人民共和国沈阳海关技术中心。 本文件主要起草人：孙敏，高宏伟，郑秋月，肖西志，崔淑华，付伟，朱水芳，徐洋，孙雯娴， 孙明君，陈盛盛，曹际娟。 I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5334.6—2020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 6 部分：转基因马铃薯 1 范围 本文件规定了进、出口马铃薯中转基因品系 AV43 特异性的数字 PCR（dPCR）定量检测方法。 本文件适用于马铃薯中转基因马铃薯 AV43 品系特异性的成分定量检测。本文件检测限参见附 录 A。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 SN/T 5334.1 转基因产品定量检测数字 PCR 方法 第 1 部分：通用要求及定义 3 术语和定义 SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。 4 方法原理 见 SN/T 5334.1。 5 主要设备及试剂 5.1 内源基因和外源基因：内源基因为马铃薯 β蔗糖转化酶（fru:） ；外源序列为转基因马铃薯 AV43 品系外源基因 5 端与马铃薯内源基因组结合区间。引物及探针序列参见附录 A。5.2 其他设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。 6 方法操作步骤 6.1 一般性操作步骤 一般性操作步骤见 SN/T 5334.1 的规定。 6.2 数字 PCR 反应体系 数字 PCR 反应体系配制见表 1。以正式出版文本为准2 SN/T 5334.6—2020表 1 数字 PCR 反应体系 试剂 体积 终浓度 内参基因扩增体系（25 μL） 2×ddPCR Super Mix 12.5 1× 内参基因上游引物（10 μmol/L） 1 200 nmol/L 内参基因下游引物（10 μmol/L） 1 200 nmol/L 内参基因探针（10 μmol/L） 1 200 nmol/L 20 ng/μL DNA 模板 5 4 ng/μL 水 补足至 25 μL 反应体系 — 外源基因扩增体系（25 μL） 2×ddPCR Super Mix 12.5 1× 品系上游引物（10 μmol/L） 1 200 nmol/L 品系下游引物（10 μmol/L） 1 200 nmol/L 品系探针（10 μmol/L） 1 200 nmol/L 20ng/μL DNA 模板 5 4 ng/μL 水 补足至 25 μL 反应体系 — 注：推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验。 6.3 数字 PCR 反应程序 6.3.1 数字 PCR 反应程序见表 2。 表 2 数字 PCR 反应程序 反应温度 反应时间 循环数 热启动a50 ℃ 2 min 1 95 ℃ 3 min 热循环（扩增）b95 ℃ 15 s 50 60 ℃ 30 s a ： 根据不同数字 PCR 平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增） 步骤。 b ： 根据不同数字 PCR 平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，后处理步骤按照不同 数字 PCR 平台说明书进行。 6.3.2 其他要求见 SN/T 5334.1。 7 结果判定与表述 结果表述如下： —— 检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明未检出马铃薯 内源基因 fru，表述为“未检出马铃薯成分” ；以正式出版文本为准3 SN/T 5334.6—2020—— 检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说 明检出马铃薯内源基因 fru，但未检出 XXX 品系特异性序列，表述为“未检出马铃薯 XXX 转基因品系” ； —— 检测结果中，内标准基因与外源基因组均符合试样数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该 转基因品系 XXX 检测为阳性且满足定量要求，表述为“检出马铃薯 XXX 转基因品系，含量为 XX%” 。 8 防污染措施 防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。 9 样品保存 样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。以正式出版文本为准4 SN/T 5334.6—2020附 录 A （资料性附录） 引物探针序列、反应程序以及检测限 表 A.1 引物探针序列、反应程序以及检测限 基因 / 品系 名称 序列（5 ’-3’）终浓度/ nmol/L退火温度 （Tm）定性检测限 定量检测限 fru上游引物 CTGCCTCCGTCAAGATTTGGTCACT 200 60 1.2 58下游引物 CTCTTCCCTTTCTTGATGG 200 探针 FAM -ACTTGTAATTCATCAAGCCAT - BHQ1 200 AV43上游引物 GGTATCAGGTTCTGGAATAAGACCAA 200 60 下游引物 TGTCGTGCCAGCTGCATTA 200 探针 FAM -CCCGCGCGTTGGCCGAT -BHQ1 200