以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5336 —2020 猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒检测 微流控芯片法 Detection of classical swine fever virus and african swine fever virus —— Microfluidic chip method 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5336—2020前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件主要起草单位：中华人民共和国上海海关、上海速芯生物科技有限公司、中华人民共和 国天津海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国青岛海关、宁波爱基因科技有限公司。 本文件主要起草人：薛俊欣、方雪恩、李健、董志珍、姜焱、蔡一村、孔继烈、岳志芹、卢先 东、刘艳红。 I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5336—2020猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒检测 微流控芯片法 1 范围 本文件规定了猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒的微流控芯片检测方法。 本文件适用于猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒的检测。对于不能通过临床症状区分的疑似猪瘟病毒或非 洲猪瘟病毒感染病例的样品，可通过本标准规定的方法进行鉴别检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 16551 猪瘟诊断技术 GB/T 18648 非洲猪瘟诊断技术 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 微流控 microfluidics 微流控是使用微管道 ( 尺寸为数十到数百微米 ) 处理或操纵微小流体的系统所涉及的科学和技术， 是涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。 3.1.2 微流控芯片技术 microfluidic chip technology 把生物、化学、医学分析过程中的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微 米尺寸的芯片上，自动完成分析全过程的技术。3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASFV ：非洲猪瘟病毒（african swine fever virus）Bst ：嗜热脂肪芽孢杆菌（bacillus stearothermophilus）CSFV ：猪瘟病毒（classical swine fever virus）DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）EDTA ：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid）FEN ：结构特异性核酸内切酶（flap structure -specific endonuclease）以正式出版文本为准2 SN/T 5336—2020RNA ：核糖核酸（ribonucleic acid） SDS ：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）Tris -HCl ：三羟甲基氨基甲烷 -盐酸（tris（hydroxymethyl）aminomethane -hydrochloric acid） Tt ：时间阈值（time threshold） 4 原理 针对猪瘟病毒（CSFV）的 5` 端非编码区和非洲猪瘟病毒（ASFV）的 VP72 基因的核酸序列设计 引物，并将其分别固定在微流控芯片的相应位置后，对微流控芯片进行封装，将提取的核酸模板与反 应液（包含 SYBR Green 荧光染料）混合后，加到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行反转录与恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物将与荧光物质进行结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有 CSFV、ASFV。 5 试剂和材料 5.1 试剂组分和存放条件见附录 A。除非另有说明，在检测中所用的试剂均为分析纯，实验室用水 应符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无核酸酶污染的容器分装。 5.2 阴性对照、阳性对照和内参对照的成分如下： a）阴性对照：无 RNase 水；b）阳性对照：从含阳性样本中提取的核酸，或人工合成的含有目标核酸序列的 DNA 片段；c）内参对照：包括扩增内参基因片段的引物（非扩增 CSFV 和 ASFV 核酸片段）和人工合成的 内参质粒（非 ASFV 和 CSFV 的基因片段） ，其中引物固定于微流控芯片反应孔中，内参质粒存在于反应液中。5.3 反应液：20 mmol/L Tris -HCl （pH 8.8） ，10 mmol/L KCl，10 mmol/L （NH4）2SO4，8 mmol/L MgSO4，0.1% 吐温 -20，1.4 mmol/L dNTPs，8000 U/mL Bst DNA 聚合酶，0.5 mg/mL FEN，50 μmol/L SYBR Green 荧光染 料，内参质粒（400 copies/ μL ）。 5.4 核酸提取试剂：可同时提取 DNA 和 RNA，包含蛋白酶 （20 mg/mL） 、磁珠 （50 mg/mL） 、裂解液、 异丙醇、洗液一、洗液二、洗液三和洗脱液，试剂配制方法见附录 B。也可以使用其他等效核酸提取 试剂或者将 DNA 或 RNA 分别提取的试剂。5.5 高温反转录酶：5000 U/ mL。 5.6 RNase 抑制剂：40 U/ μL 。 5.7 引物：猪瘟病毒引物与非洲猪瘟病毒引物见附录 A。 5.8 微流控芯片：5 μL / 反应池，8×4 离心微流控芯片。微流控芯片制作参见附录 C，也可以根据 实际需求选择其他类型的等效商品化的微流控芯片。 5.9 耗材：封口膜、无 RNase 吸头（10 μL、100 μL、1000 μL） 、无 RNase 离心管（1.5 mL、2 mL） 。 6 器材和设备 6.1 微流控芯片检测仪。 6.2 纯水仪。 6.3 恒温干燥箱。 6.4 漩涡振荡仪。以正式出版文本为准3 SN/T 5336—20206.5 微量点样仪。 6.6 低温冷冻离心机。 6.7 低温冰箱。 6.8 移液器（0.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL ）。 7 生物安全措施 7.1 实验室设备、设施及废弃物处理等要求应符合 GB 19489 的规定。 7.2 微流控芯片的检测过程应符合国家有关生物安全规定。 7.3 检验过程中防止交叉污染的措施应符合 GB/T 27401 的规定。 8 试验方法 8.1 样品 所有测试样品的采集和样品制备应按照 GB/T 16551、GB/T 18648 的规定执行。 8.2 核酸提取 8.2.1 核酸提取试剂 CSFV 属于 RNA 病毒，ASFV 属于 DNA 病毒，本文件以常规核酸提取试剂（可同时提取 DNA 和 RNA）为例说明核酸提取步骤，也可采用 GB/T 16551、GB/T 18648 所规定的提取方法。为了确保核酸提 取的准确可靠，每个测试样品提取时应做两个重复，在后续检测中两份核酸以同样的操作步骤实施检测。 8.2.2 核酸提取纯化准备 裂解液如有沉淀，应于 56 ℃温浴至沉淀完全溶解后使用。 将蛋白酶充分混匀后，按照每管 20 μL 分装至各离心管中。 8.2.3 核酸提取纯化 核酸的提取纯化步骤如下：a）向上述已加蛋白酶的离心管中加入 200 μL 制备好的样本，混匀；再加入 400 μL 裂解液，漩 涡振荡 10 s，56 ℃孵育 10 min ；2 ℃ ~ 8 ℃ 8 000 g 离心 1 min，取上清待用； b）加入 300 μL 异丙醇和 2 μL 磁珠，上下颠倒离心管 10 次，使管内磁珠分布均匀； c）静置离心管 10 min，期间每隔 2 min 上下颠倒离心管 5 次，使管内磁珠分布均匀；d）将离心管置于离心机上，2 ℃ ~ 8 ℃ 8 000 g 离心 1 min，用移液器吸去管内液体；e）加入 500 μL 洗液一，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡 10 s，直至其分布均匀； f）将离心管置于离心机上，2 ℃ ~ 8 ℃ 8 000 g 离心 1 min，用移液器吸去管内液体；g）加入 500 μL 洗液二，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡 10 s，直至其分布均匀； h）将离心管置于离心机上，2 ℃ ~ 8 ℃ 8 000 g 离心 1 min，用移液器吸去管内液体；i）加入 500 μL 洗液三，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡 10 s，直至其分布均匀； j）将离心管置于离心机上，2 ℃ ~ 8 ℃ 8 000 g 离心 1 min，用