以正式出版文本为准I C S1 1.2 2 0 C C SB4 1 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 3 8—2 0 2 1 虎物种鉴定 实时荧光 P C R方法 I d e n t i f i c a t i o n f o r t ige r spe c i e s—R e a l - t i m e P C R m e t h o d 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国杭州海关 、中华人民共和国宁波海关 、中华人民共和国绍兴海关 。 本文件主要起草人 :吴姗、赵秀玲、张明哲、虞惠贞、尹文秀、张晓峰、任明兴、孙超、张荃。 ⅠS N/T5 3 3 8—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准虎物种鉴定 实时荧光 P C R方法 1 范围 本文件规定了虎种 (P a n t h e r a t igr i s)的实时荧光 P C R鉴定方法 。 本文件适用于虎种内现存的 6个亚种虎 ,包括东北虎 (P a n t h e r a t igr i s a l t a i c a) 、华南虎(P a n t h e r a t igr i s a m oye n s i s) 、孟加拉虎 (P a n t h e r a t igr i s t igr i s) 、印度支那虎 (P a n t h e r a t igr i s c o r b e t t i ) 、马来虎 (P a n t h e r a t igr i s ja c k s o n i)和苏门答腊虎 (P a n t h e r a t igr i s s uma t r a e )及其制品的定性鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1.1 实时荧光 P C R r e a l - t i m e P C R 在P C R扩增时加入带有荧光基团的特异性探针 (T aqm a n探针)或荧光染料 ,使P C R产物的积累 与荧光信号的积累完全同步 ,实现P C R产物的实时监测 。 3.1.2 C t值 cyc l e t h r e s h o l d v a l u e 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 bp:碱基对(b a s e pa i r) C TA B:十六烷基三甲基溴化铵 (c e tyl t r i t hyl a mm o n i u m b r o m i d e ) Cyt b基因:高等生物细胞中线粒体的细胞色素 b基因(cyt o c h r o m e b) DNA:脱氧核糖核酸 (d e o xyr i b o n u c l e i c a c i d) d NT P:脱氧核苷酸三磷酸 (d e o xyr i b o n u c l e o s i d e t r iph o sph a t e) E DTA:乙二胺四乙酸 (e t hyl e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d) F AM:6 -羧基荧光素 (6 - c a r b o x yf l u o r e s c e i n ) OD:光密度值 (opt i c a l d e n s i ty) P C R:聚合酶链式反应 (po lym e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) ROX:羧基- X -罗丹明(c a r b o xy- X - r h o a m i n e) 1S N/T5 3 3 8—2 0 2 1以正式出版文本为准T aq酶:从水生热栖菌中分离出的具有热稳定性的 DNA聚合酶(t h e r m u s aqu a t i c u) T E:T r i s - HC l 、E DTA缓冲液 T r i s:三(羟甲基)氨基甲烷 [t r i s (hyd r o xym e t hyl) a m i n o m e t h a n e ] 4 试剂和材料 除另有规定外 ,试剂为分析纯或生化试剂 。试验用水应符合 G B/T 6 6 8 2中一级水的规定 。所有试 剂均用无 DNA酶污染的容器分装 。 4.1 液氮。 4.2 0. 5 m o l/L E DTA缓冲液(pH 8. 0) 。 4.3 C TA B 裂解液(2. 0%) :2 0 g/L C TA B,0. 1 m o l/L T r i s - HC l (pH 8. 0) ,1. 4 m o l/L N a C l, 2 0 mm o l/L E DTA(pH 8. 0) 。 4.4 C TA B 沉淀液(0. 5%) :5 g/L C TA B,4 0 mm o l/L N a C l。 4.5 蛋白酶K溶液(2 0 mg/mL) 。 4.6 N a C l溶液(1. 2 m o l/L) 。 4.7 RN a s e A酶。 4.8 三氯甲烷 。 4.9 异丙醇。 4.1 0 体积分数为 7 0%的乙醇。 4.1 1 T E缓冲液:1 0 mm o l/L T r i s - HC l (pH 8. 0) ,1 mm o l/L E DTA缓冲液(pH 8. 0) 。 4.1 2 实时荧光 P C R反应混合液 :1 0 μL反应体系包括 :1 U~2 U(u n i t,酶学单位 )的T aq酶、1×P C R 缓冲液、2. 5 mm o l/L~4. 0 mm o l/L的Mg2+、0. 2 mm o l/L的d(A,C,G)T P s、0. 2 mm o l/L~ 0. 4 mm o l/L d UT P、4 0 0 mm o l/L ROX染料(某些荧光 P C R仪不需要 ROX校正) 。如果具有等效的 商品化试剂盒 ,则可使用这些等效产品 。 4.1 3 引物与探针 :虎种的实时荧光 P C R检测所用的引物和探针序列见表 1。 表1 引物和探针序列 名称 序列 目的基因名称及序列号 扩增片段长度 虎5’端引物 5’- C TAC C C R C C C CAT C CAATAT - 3 ’ 虎3’端引物 5’- GTAGTTTAC GT C G C GG CAAA - 3 ’ 虎探针 5’- F AM - T CAC TGG C C T C TTT C TAG C C - E C L I P S E - 3 ’线粒 体 的 Cyt b基 因, J F 3 5 7 9 6 8. 11 6 6 bp 注: 虎引物探针扩增的靶标序列见附录 A。虎种信息见附录 B。 5 仪器设备 5.1 实时荧光 P C R仪。 5.2 恒温水浴锅或干式恒温器 。 5.3 离心机:最大离心力不小于 1 6 0 0 0 g。 5.4 微量移液器 :2. 5 μL、1 0 μL、2 0 μL、1 0 0 μL、2 0 0 μL、1 0 0 0 μL。 5.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。 5.6 pH计。 2S N/T5 3 3 8—2 0 2 1以正式出版文本为准5.7 涡旋振荡仪 。 5.8 研钵。 5.9 冷冻粉碎均质装置 。 5.1 0 天平:感量0. 0 1 g。 5.1 1 高压灭菌器 。 5.1 2 锉刀或电钻 。 6 检验步骤 6.1 制样 6.1.1 肌肉、内脏等组织 :取适量(由于制备一份 DNA样本至少需要 2 0 0 mg的样本,考虑到制备时的 损耗和重复 ,可取1 g左右的样品 )样品放入研钵 ,用液氮(4. 1)充分研磨至糜状 ;或采用合适的冷冻粉 碎均质装置 (5. 9)对样品进行充分地研磨至糜状 。 6.1.2 血液:可直接进行 DNA提取,无需制样 。 6.1.3 骨骼、牙齿(带牙髓) :使用锉刀或电钻 (5. 1 2)等工具,将样品制备成粉末状 。 6.1.4 毛发(带毛囊) :采用冷冻粉碎均质装置 (5. 9)对样品进行充分地研磨至粉末状 。 6.2 脱钙处理 上述6. 1涉及的样品 ,牙齿样品需进行脱钙处理 ,其余样品制样后可直接进入 6. 3. 1的DNA提取 步骤。 取制备好的粉末状牙齿样品 2 0 0 mg于2 mL离心管中 ,加入1. 5 m l 0. 5 m o l/L E DTA缓冲液 (pH 8. 0) (4. 2) ,3 7 ℃恒温1 2 h,1 5 0 0 0 g离心1 m i n,弃尽上清 。脱钙处理后的样品可进入 6. 3. 1的 DNA提取步骤 。 6.3 样品D N A提取 6.3.1 称取约2