以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0.0 1 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 8 4—2 0 2 1 辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法 D e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f C h i l l i v e i n a lm o t t l ev i r u s 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国福州海关 、福建农林大学 、中国检验检疫科学研究院 、中国农业科 学院生物技术研究所 、中华人民共和国厦门海关 。 本文件主要起草人 :蔡伟、高芳銮、邓真、陈细红、张永江、李为民、李敏、廖富荣、林春滢、杨宏凯。 ⅠS N/T5 3 8 4—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了辣椒脉斑驳病毒检测的程序和方法 。 本文件适用于进出境寄主植物及产品中辣椒脉斑驳病毒的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 S N/T2 1 2 2 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 辣椒脉斑驳病毒基本信息 中文名:辣椒脉斑驳病毒 学名:C h i l l iV e i n a lM o t t l ev i r u s ;C h i VMV 。 分类地位 :马铃薯Y病毒科(P o tyv i r i d a e) 、马铃薯Y病毒属(P o tyv i r u s)成员。 辣椒脉斑驳病毒的寄主范围 、病害症状 、分布地区 、传播途径 、粒体形态 、基因组等其他信息参见附 录A。 5 原理 辣椒脉斑驳病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据 。 6 仪器设备 、用具及试剂 6.1 仪器设备 高速冷冻离心机 、电子天平 (1/10 0 0g) 、P C R仪、电泳仪、水平电泳槽 、-2 0℃低温冰箱和 -8 0℃ 超低温冰箱 、凝胶成像分析系统 、pH计、微波炉、磁力搅拌器 、恒温水浴锅 、高压灭菌锅 、超净工作台 、酶 标仪等。 6.2 用具 各种量程的可调移液器 (10 0 0μL、2 0 0μL、1 0 0μL、2 0μL、1 0μL、2μL) 、P C R反应管、无RN a s e离 1S N/T5 3 8 4—2 0 2 1以正式出版文本为准心管(1. 5mL) 、研钵、酶联板等 。 6.3 试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 (DA S - E L I S A )试剂按照附录 B执行、免疫层析试纸条试剂按照附录 C执行、R T - P C R 试剂按照附录 D执行。除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 G B/T6 6 8 2 中相关规定 。 7 检测与鉴定 7.1 抽样检查 按照S N/T2 1 2 2给出的方法进行抽样 、取样,并检查植株是否有矮化 、畸型,叶片花叶 、斑驳等疑似 病毒危害症状 。 7.2 样品制备 分别按照有症状和无症状进行样品制备 。有症状植株每株单独编号并采集症状部位制样 ;无症状 植株,5株为一组编号并混合制样 。称取0. 5g~1. 0g待测样品按 1∶1 0(质量:体积,W/V)加入抽提缓 冲液,用研钵研磨成浆 ,4℃下1 00 0 0g离心1 0m i n,上清即为样品提取液 ,用于DA S - E L I S A 、免疫层 析试纸条和 RT - P C R 检测;或称取0. 1g待测样品提取核酸后用于 RT - P C R 检测。 7.3 D A S - E L I S A 具体方法按附录 B检测。 7.4 免疫层析试纸条 具体方法按附录 C检测。 7.5 R T - P C R 具体方法按附录 D检测。 7.6 序列测定与比对 P C R产物纯化后直接测序或者克隆测序 ,利用NC B I网站上的 B LA S T 软件把测序所得到的核苷 酸序列与已知 C h i VMV 序列进行比对 。 8 结果判定 DA S - E L I S A 或免疫层析试纸条检测结果为阴性 ,且RT - P C R 检测结果为阴性 ,则判定样品不携带 C h i VMV 。 DA S - E L I S A 或免疫层析试纸条检测结果为阴性 ,但RT - P C R 检测为阳性 ,则需进一步序列测定 。 序列测定结果经比对分析为 C h i VMV ,则判定样品携带 C h i VMV 。 DA S - E L I S A 或免疫层析试纸条检测结果为阳性 ,则采用RT - P C R 方法进行验证 ,若验证结果为阳 性,则判定样品携带 C h i VMV ;若验证结果为阴性 ,则判定样品不携带 C h i VMV 。 9 结果记录与样品保存 9.1 结果记录 记录好各项实验数据 ,包括样品来源 、种类、时间,实验的时间 、地点、方法和结果等 ,并要有经手人 2S N/T5 3 8 4—2 0 2 1以正式出版文本为准和实验人员的签字 。血清学DA S - E L I S A 检测结果保留吸光值的数据报告 、免疫层析试纸条检测保留 试纸条检测图片 、RT - P C R 检测结果保留电泳照片 、序列测定保留测序报告 。 9.2 样品保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在 -2 0℃或-8 0℃冰箱中,并作好登记和标记工作 ,以 备复核用 。 3S N/T5 3 8 4—2 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A (资料性) 辣椒脉斑驳病毒的背景资料 A.1 寄主范围 已报道的自然寄主为辣椒 (C aps i c u ma n n u u mL .) 、烟草(N i c o t i a n at a b a c u mL .) 、番茄(S o l a n u m lyc ope r s i c u mL .) 、茄子(S o l a n u mm e l o n ge n aL.)等作物。 A.2 病害症状 该病毒在不同寄主上引起的症状存在一定差异 。C h i VMV 侵染辣椒后引起的典型症状是叶脉出 现暗绿条纹 ,叶沿皱缩 ,叶片变小 ,结果前严重落花 。此外,还可引起辣椒果实出现斑驳 、畸形等症状 。 见图A. 1。 (引自h t tp: / /ip pc . a c f s .go. t h/pe s t/G 0 0 1/T 0 0 6/V I RU S 0 0 7 ) 图A.1 C h i VMV 侵染引起的症状 A.3 分布地区 马来西亚 、韩国、泰国、印度、中国、日本、朝鲜、巴基斯坦 、菲律宾、斯里兰卡 、越南、坦桑尼亚和巴布 亚新几内亚等国家 。 A.4 传播途径 主要通过蚜虫以非持久性方式传播 ,同时能通过机械接种传播 。 A.5 粒体形态 病毒粒体呈弯曲线状 ,长约9 0 0n m,直径约1 4n m。见图A. 2。 4S N/T5 3 8 4—2 0 2 1