以正式出版文本为准ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5388—2021 烟草线条病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Tobacco streak virus 2021-06-18发布 2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 烟草线条病毒检疫鉴定方法 SN/T 5388—2021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7531 网址 www.customskb.com/book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1 字数29千字 2021年7月第一版 2021年7月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·683 定价16.00元以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规则 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福州市金山公园管理处、中华人民共和国哈尔滨海关、 中国农业科学院生物技术研究所、中华人民共和国厦门海关、中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人:沈建国、刘向国、邓真、刘洪义、李为民、廖富荣、李敏、张永江、陈细红、陈寿铃。 ⅠSN/T5388—2021以正式出版文本为准以正式出版文本为准烟草线条病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了烟草线条病毒的检疫鉴定方法。 本文件适用于可能携带烟草线条病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 烟草线条病毒基本信息 中文名:烟草线条病毒 学名:Tobacco streak virus;TSV。 分类地位:雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)成员。 烟草线条病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附 录A。 5 原理 烟草线条病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 6 仪器设备、用具及试剂 6.1 仪器设备 pH计、酶标仪、高速冷冻离心机、电子天平、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像 分析系统、常规冰箱、超低温冰箱、恒温水浴锅、高压灭菌锅、研磨仪等。 6.2 用具 各种量程的可调移液器(1 000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2 μL)、PCR反应管、无RNase离 心管(1.5 mL)、研钵、酶联板等。 1SN/T5388—2021以正式出版文本为准6.3 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。双抗体夹心酶联 免疫吸附测定(DAS-ELISA)试剂按照附录B执行、RT-PCR试剂按照附录C执行、实时荧光RT-PCR 试剂按照附录D执行。 7 检测与鉴定 7.1 抽样检查 按照SN/T 2122给出的方法进行抽样、取样,并检查植株是否有矮化、畸形,叶片花叶、斑驳等疑似 病毒危害症状。 7.2 样品制备 7.2.1 种子类样品 选取外观畸形或不成熟的种子,单独挑选出来作为一个样品进行检测;若种子无明显异常,则随机 称取1 g~3 g种子,按1∶10(质量∶体积,W/V)加入抽提缓冲液研磨,4 ℃下10 000 g离心10 min, 上清即为样品提取液,用于DAS-ELISA、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测;或称取0.1 g样品提取核 酸后用于RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测。 7.2.2 植株类样品 植株类样品分别按照有症状和无症状进行样品制备。有症状植株每株单独编号并采集症状部位制 样;无症状植株,5株为一组编号并混合制样。称取0.5 g~1.0 g样品组织按1∶10(质量∶体积,W/ V)加入抽提缓冲液研磨,4 ℃下10 000 g离心10 min,上清即为样品提取液,用于DAS-ELISA检测、 RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测;或称取0.1 g样品提取核酸后用于RT-PCR、实时荧光RT-PCR检 测。 7.3 DAS-ELISA 具体方法按照附录B。 7.4 RT-PCR 具体方法按照附录C。 7.5 实时荧光RT-PCR 具体方法按照附录D。 7.6 序列测定与比对 PCR产物纯化后,直接测序或者克隆测序,利用NCBI网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷 酸序列与已知TSV序列进行比对。 8 结果判定 样品检测时,检测结果判定按下述原则进行。 2SN/T5388—2021以正式出版文本为准 ———DAS-ELISA初筛结果为阴性,且RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法检测结果为阴性,则判定 样品不携带TSV。 ———DAS-ELISA初筛结果为阳性,则采用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行验证。若验证 结果为阳性,则判定样品携带TSV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带TSV。 ———DAS-ELISA初筛结果为阴性,但RT-PCR检测为阳性,则需进一步序列测定。序列测定结果 经比对分析为TSV,则判定样品携带TSV。 ———RT-PCR检测结果为阳性,且实时荧光RT-PCR检测结果为阳性,则判定样品携带TSV。 9 结果记录与样品保存 9.1 结果记录 记录好各项实验数据,包括样品来源、种类、获得时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有经 手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告,分子生物学检测结果保留电泳照片、 序列测定分析报告及实时荧光结果图片。 9.2 样品保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20 ℃或-80 ℃冰箱中,并做好登记和标记工作,以 备复核用。 3SN/T5388—2021以正式出版文本为准附 录 A (资料性) 烟草线条病毒的背景资料 A.1 寄主范围 已报道的寄主范围较广,可侵染30个科的200多种单子叶和双子叶植物。 A.2 病害症状 TSV侵染寄主后,能够对其产量造成较大影响,引起的症状因寄主不同存在一定的差异,如引起烟 草系统性坏死条斑,大丽花、棉花、红车轴草、草木樨斑驳,番茄黄色环斑和畸形,芦笋矮化,玫瑰脉黄化, 大豆、豌豆、辣椒系统性坏死,马铃薯轻花叶,草莓坏死休克等。见图A.1。 (引自Paul Bachi, University of Kentucky Research and Education Center, Bugwood.org) 图A.1 TSV侵染烟草引起的症状 A.3 分布地区 主要分布于巴西、秘鲁、丹麦、法国、英国、阿根廷、美国、加拿大、澳大利亚和新西兰等国家。 A.4 传播途径 机械接种传播;种子、花粉传播;蓟马传播。 A.5 粒体形态 等轴对称二十面体到准等轴对称颗粒,直径为27 nm~35 nm。见图A.2。 4SN/T5388—2021