以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0.0 1 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 8 9—2 0 2 1 香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴定方法 D e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f Myc o sph a e r e l l am u s i c o l a R.L e a c he xJ .L.Mu l d e r 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴定方法 S N/T5 3 8 9—2 0 2 1 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1号(1 0 0 0 2 3) 编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 1 网址www. c u s t o m s k b. c o m /b o o k 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8 8 0×1 2 3 0 1 /1 6 印张0. 7 5 字数2 1千字 2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷 印数1—5 0 0 * 书号:1 5 5 1 7 5·6 8 2 定价1 2.0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国乌鲁木齐海关 、中国科学院微生物研究所 、广西科学院 。 本文件主要起草人 :张祥林、蔡磊、王翀、赵鹏、刘芳、刁永朝、李典鹏、史向向。 ⅠS N/T5 3 8 9—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了香蕉黄条叶斑病菌 Myc o sph a e r e l l amu s i c o l a R. L e a c he xJ . L. Mu l d e r 的检疫鉴定 方法。 本文件适用于香蕉属的植物及相关寄主植物的种苗 、其他繁殖材料及其产品 (尤其是果实 )中香蕉 黄条叶斑病菌的检疫鉴定 。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 香蕉黄条叶斑病菌基本信息 中文名:香蕉黄条叶斑病菌 、香蕉假尾孢菌 学名:Myc o sph a e r e l l amu s i c o l a R. L e a c he xJ . L. Mu l d e r ,Myc o l . P ap. 1 4 0:1 4 8. 1 9 7 6. 无性阶段 :P s e u d o c e r c o s po r amu s a e (Z i mm.)D e igh t o n 分类地位 :香蕉黄条叶斑病菌隶属于真菌界 (F u ngi) ,子囊菌门 (A s c o myc o t a) ,座囊菌纲 (D o t h i d e o - myc e t e s) ,煤炱目(C apn o d i a l e s ) ,球腔菌科 (Myc o sph a e r e l l a c e a e ) ,小球壳属 (Myc o sph a e r e l l a ) 。 5 鉴定原理和流程 5.1 鉴定原理 根据香蕉黄条叶斑病菌的危害症状 (参见附录 A) ,分离培养形态特征进行初步判断 ,设计特异性 P C R引物和探针 ,建立基于实时荧光 P C R方法,对香蕉黄条叶斑病菌进行鉴定 。 5.2 鉴定流程 鉴定流程见图 1。 1S N/T5 3 8 9—2 0 2 1以正式出版文本为准 图1 鉴定流程 6 仪器和试剂 6.1 仪器 显微镜、解剖镜、天平、研钵、烘箱、高压灭菌锅 、水浴锅、摇床、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器 、台式离 心机、核酸蛋白分析仪 、高速冷冻离心机 、真空抽干仪 、冰箱、超净工作台 、生化培养箱 、通风橱、实时荧光 P C R仪、微量移液器 (0. 1μL~2. 5μL,1μL~1 0μL,1 0μL~5 0μL,2 0μL~2 0 0μL,1 0 0μL~10 0 0 μL) 。 6.2 试剂 除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯或生化试剂 。 应至少购置如下试剂或者相应的真菌 DNA提取试剂盒 : 分离培养所需要的试剂为 1%次氯酸钠 (N a C l O) 、7 5%酒精、无菌水、马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (马 铃薯葡萄糖琼脂粉 3 7g,蒸馏水10 0 0mL ,1 2 1℃湿热灭菌 2 0m i n备用) 、硫酸链霉素 、氨苄青霉素钠 、 磷酸二氢钾 (KH2P O4) 、硝酸钾(KNO 3) 、七水硫酸镁 (MgS O4·7H2O) 、氯化钾(KC l) 、葡萄糖、蔗糖、 琼脂。 DNA提取试剂或真菌 DNA提取试剂盒 :C TA B提取液(2% C TA B ,1. 4m o l/LN a C l,2 0mm o l /L E DTA,1 0 0mm o l /LT r i s·HC lpH8. 0) 、三氯甲烷 、异戊醇、异丙醇、无水乙醇 、RN a s e。 荧光P C R反应所需试剂 :P C R混合液(含缓冲液 ,氯化镁,d NT P s,T aq酶) 、特异性引物探针 、超 纯水。 7 检疫鉴定方法 7.1 病原菌的分离培养 症状检查 :观察叶片是否出现微变色 ,形成细小 、黄绿色病纹或暗褐色条纹病斑或有外围黄色晕环 ; 是否有椭圆形褐色或锈红色 ,外缘有黑色或深褐色细线黄色晕圈的病斑 ;是否有灰色霉状物 。 挑取发病材料病斑用流水充分冲洗后 ,用1%次氯酸钠和 7 5%酒精分别浸泡 1m i n进行表面灭菌 , 然后用无菌水冲洗 3次,用灭菌镊 、剪在无菌水中将分离材料剪成 2c m~3c m 大小的方块 ,置于灭菌滤 纸上,吸干水分后放置于倒有 P DA的培养皿中 。培养皿放置在 2 5℃条件下光照培养箱中培养 (光照和 黑暗1 2h交替) ,第3天开始观察 ,发现疑似菌落后纯化培养 ,显微观察形态特征 。 2S N/T5 3 8 9—2 0 2 1以正式出版文本为准7.2 实时荧光 P C R检测 按照附录 B进行检测 。 7.3 致病性测定 致病性测定为选做 。 将形态特征与香蕉黄条叶斑病菌相符且实时荧光 P C R检测阳性的分离物进行致病性测定 。选用 健康的香蕉植株进行致病性测定 ,对香蕉叶片进行表面消毒 ,无菌水冲洗 ,进行针刺接种 。用灭菌牙签 或刀片在果皮处穿刺或切开组织 ,用无菌打孔器在培养基上取香蕉黄条叶斑病菌菌丝块 ,接种在伤口 上,用湿润的脱脂棉包裹伤口 ,用塑料袋覆盖 ,2 5℃左右,相对湿度 1 0 0%,黑暗条件下保湿 4 8h,接种后 5d~1 0d 后观察接种点附近是否出现可疑病斑 ,观察症状并对果实发病处再做病原菌分离 ,若接种样 品中分离出的菌株培养性状和形态特征符合第 8章中的描述 ,且P C R扩增结果呈阳性 ,可判定致病性 测定阳性 。 8 形态学鉴定特征 病原菌的形态观察 :香蕉黄条叶斑病菌菌落在培养基上初为白色 ,培养2d后菌落中央变为深灰 色,菌落疏展 ,培养4d后菌落变为灰绿色 ,培养1 0d后成熟的菌落进一步变为灰绿色 。 分生孢子梗培养 2d后出现,丛生,直立或稍弯曲 ,瓶状,无分隔,顶端钝圆 ,无明显孢痕 ;分生孢子 单个着生 ,浅白色或浅褐色 ,光滑,直立或稍弯曲 ,圆筒形至倒棍棒形 ,顶端和基部钝圆 ,基部无明显孢 痕,有3~5个横膈膜 ,大小为1 0μm~8 0μm×2μm~6μm,平均1 8. 5μm×3μm。 形态学鉴定特征按照附录 C执行。 9 结果判定 以形态学特征和实时荧光 P C R检测结果作为判定依据 ,进行综合判定 : 若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第 8章鉴定特征吻合 ,且实时荧光 P C R检测结果为 阳性,判定为检出香蕉黄条叶斑病菌 Myc o sph a e r e l l amu s i c o l a ; 若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第 8章鉴定特征不吻合 ,且实时荧光 P C R检测结果 为阴性,判定为未检出香蕉黄条叶斑病菌 Myc o sph a e r e l l amu s i c o l a ; 若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第 8章鉴定特征吻合 ,且实时荧光 P C R检测结果为 阴性,判定为未检出香蕉黄条叶斑病菌 Myc o sph a e r e l l amu s i c o l a 。 1 0 记录和样品保存 1 0.1 样品保存 对检出香蕉黄条叶斑病菌的样品应保存于 4℃冰箱中,以备复核 ,该类样品按照实验室样品管理办 法保存期满后经高压灭菌后方可处理 。 分离到的香蕉黄条叶斑病菌应接种于 P DA培养基中妥善保存 。 1 0.2 结果纪录与资料保存 包括:样品的来源 、种类、采样时间 、检测时间 、地点、方法、结果等,并有实验人员的签字 。荧光 P C R要有荧光结果图片 。 3S N/T5 3 8 9—2 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A (资料性) 香蕉黄条叶斑病危害症状 、发生与分布 A.1 危害症状 多在上部叶片显症 。初期症状是叶片出现轻微变色 ,形成细小 、黄绿色病纹 ,扩展后,形成与叶脉平 行的暗褐色条纹病斑 ,外围黄色晕环 。以后病斑逐渐扩展成