SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1699-2017 代替SN/T1699.12006,SN/T1699.2—2006,SN/T1699.3--2006 猪流行性腹泻检疫技术规范 Quarantine protocolfor pofcine epidemic diarrhea 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 刮涂层查真伪 SN/T1699—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1699.1-2006猪流行性腹泻微量血清中和试验操作规程》、SN/T1699.2—2006 《猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程》、SN/T1699.3-2006《猪流行性腹泻间接斑点酶联免 疫吸附试验操作规程》。 本标准与SN/T1699.1—2006、SN/T1699.2—2006、SN/T1699.3-2006相比，主要技术变化 如下： 增加了猪流行性腹泻病毒分离鉴定方法； -增加了反转录-聚合酶链式反应方法； -增加了实时荧光反转录聚合酶链式反应方法； -增加了酶联免疫吸附试验方法，取代间接斑点酶联免疫吸附试验操作规程； 修改了直接免疫荧光试验操作规程，采纳NY/T544-2015《猪流行性腹泻诊断技术》中6.2 “直接免疫荧光法”，并对其操作步骤进行细化描述； 内容进行了修改和补充。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、华南农业大学、中华人民共和国深圳出 入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈茹、马保华、马静云、艾青、朱道中、程珏益、秦智锋、杨俊兴、杨健、刘志玲、 伍绮文、罗琼、段燕喻、孙洁、林志雄、陈兵、王莹、鱼海琼。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1699.1—2006; SN/T1699.2—2006; -SN/T1699.3—2006。 1 SN/T1699—2017 猪流行性腹泻检疫技术规范 1范围 本标准规定了猪流行性腹泻的病毒分离鉴定、反转录聚合酶链式反应、实时荧光反转录聚合酶链式 反应、直接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和微量血清中和试验的实验室检疫技术规范。 本标准适用于进出境猪中猪流行性腹泻的检疫、疫情监测和诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PED：猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea） PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline） Vero：非洲绿猴肾细胞 DMEM：一种改良细胞培养液（dulbecco'smodifiedeaglemedium） CPE：致细胞病变效应（cytopathiceffect） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction） ddH，O：双蒸水(doubledistilledwater) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） BSA：牛血清白蛋白（bovineserumalbumin） Ct：荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 FITC：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate） ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay） TMB：33'，5,5"-四甲基联苯胺（3,3，5.5-Tetramethylbenzidine) OD：光密度（opticaldensity) TCIDso：半数组织培养感染剂量（tissuecultureinfectivedose） 猪流行性腹泻概述 猪流行性腹泻（PED)是由冠状病毒科（Coronauiridae）、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（PEDV） 引起的一种急性高度接触性猪肠道传染病，临床表现呈水样腹泻、呕吐、脱水、运动僵硬和哺乳仔猪高死 亡率等特征。各种年龄猪均可感染，其中以1周龄内的哺乳仔猪最为易感。PEDV主要通过被感染猪 的粪便或其他病毒污染物传播，自然条件下，PEDV通过口与鼻途径进入猪的体内。PED的流行无明 SN/T1699—2017 显季节性，但多在寒冷季节发生。 5实验室诊断技术 5.1病毒分离鉴定 5.1.1器材与设备 CO2培养箱、倒置显微镜、台式冷冻离心机、冰箱；剪刀、镊子、离心管、研钵、0.22um微孔滤器、细 胞培养瓶或细胞培养板。 5.1.2试剂与材料 本标准所用水为符合GB/T6682中规定的二级水。除特殊规定外，本标准所用试剂均指分析纯 试剂。 制方法见附录A的A.1。 5.1.3操作方法 5.1.3.1 样品采集与预处理 采集腹泻猪的粪便、死亡病猪的肠道及内容物。取粪样、肠内容物或肠道样品（经剪取处理），按1：5 速离心10min，取上清液；在4℃10000r/min离心10min，取上清液，用0.22μm微孔滤器过滤除菌： 将样品滤液分装，立即使用或置一80℃备用。 5.1.3.2病毒分离 5.1.3.2.1接种 取长成单层（一般生长1d～2d形成80%以上单层即可）生长良好的Vero细胞，弃去培养液，用 0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液清洗细胞3次，将上述样品滤液按细胞培养液用量的10%接种到Vero 细胞单层，加人含5ug/mL～10ug/mL胰蛋白酶（根据细胞状况等实际情况调整确定具体采用的胰蛋 白酶浓度）的DMEM细胞培养液（用量约占接种量的50%），在37℃5%CO，培养箱吸附1.5h，期间 轻摇3次，根据培养瓶或培养孔大小，添加含5ug/mL～10μg/ml.胰蛋白酶的DMEM细胞培养液至 常规培养用量。同步设置不接种滤液的正常细胞对照和接种同类阴性猪临床样品的对照。 5.1.3.2.2显微镜观察与传代 采用倒置显微镜观察细胞培养物，逐日观察3d～5d；根据致细胞病变效应（CPE)变化情况，按以 下操作盲传2代～3代：收集细胞培养物，反复冻融3次，在4℃8000r/min离心10min，取上清液， 用0.22um微孔滤器过滤除菌，再按上述同样操作进行接种和传代。其特征性CPE是细胞面粗糙、颗 粒增多，部分细胞核逐渐融合，形成合胞体，并可见空斑样小区，细胞逐渐脱落。 5.1.3.3病毒鉴定 收集上述病毒分离培养物，采用常规RT-PCR、实时荧光RT-PCR或直接免疫荧光试验等方法（见 5.25.4中有关细胞培养物的内容)进行PED病毒检测鉴定，出现阳性结果即可判定为PED病毒分离 鉴定阳性。 2 SN/T1699—2017 5.2常规RT-PCR 5.2.1设备与器材 PCR仪、恒温水浴箱，烘箱，台式冷冻离心机（离心转速可达到12000r/min以上），振荡混匀器，电 泳仪，凝胶成像仪或紫外透射仪，冰箱（2℃～8℃、一20℃、一80℃），微量移液器（10μL、100mL、 1000μL)及配套吸嘴，微量离心管，微量PCR反应管。RNA操作所涉及的耗材使用无RNA酶产品。 5.2.2试剂 本标准所用水为符合GB/T6682中规定的二级水。除特殊规定外，本标准所用试剂均指分析纯 试剂。 TRIzol试剂，三氟甲烷，异丙醇，乙醇，Taq酶，逆转录酶（RTase），核糖核酸酶（RNase）抑制剂， dNTPs混合物（dATP、dTTP、dCTP和dGTP各1ommol/L），无核酸酶水（DNase，RNase-free ddH2O，可用商品化产品，或采用DEPC处理水），DNA标准分子量（DNAMarker），DNA上样缓冲液， Goldview或其他等效核酸染料，琼脂糖，TAE电泳缓冲液。溶液与试剂配制方法见附录A中A.2。 5.2.3RT-PCR扩增引物 上游引物：5"-CAGCATCCTTATGGCTTGC-3”； 下游引物：5"-AGCATTGACTGAACGACCAAC-3”。 采用无核酸酶水将每条引物配制成100μmol/L。储存液，置一20℃以下冻存；使用时，取适量配 制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。 5.2.4样品采集、预处理、核酸提取 5.2.4.1样品采集与预处理 猪粪样、肠道及其内容物等临床样品的采集及预处理操作方法同5.1.3.1。 细胞培养物样品的预处理方法：收集病毒分离或接种病毒的细胞培养物，反复冻融3次，在4℃ 8000r/min离心10min，取上清液。 5.2.4.2核酸提取 取上述待检样品上清液200μL置于灭菌微量离心管（1.5mL)中，加人600μlTRIzo试剂，反复 颠倒混匀后室温静置15min。短暂离心以收集管壁液滴，加入200μL三氯甲烷，震荡混匀，室温静置 醇，上下颠倒混匀后室温静置10min。4℃12000r/min离心15min。倒掉上清液，加人75%乙醇 1mL，上下颠倒洗涤离心管。4℃12000r/min离心10min，吸弃上清液，将离心管倒扣在吸水纸上自 然晾干。加人50μL无核酸酶水，室温静置5min，短暂离心以收集管壁液滴。纯化核酸溶液可直接用 于后续检测，或贮存于低温备用（一20℃以下）。 也可采用经验证可靠的病毒核酸提取纯化试剂盒进行核酸提取，参照说明书进行操作。 5.2.5RT-POR检测