SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3567.10—2017 交引物恒温扩增检测方法 第10部分：炭疽芽孢杆菌 Detection method of crossing priming isothermal amplification- Part 10 : Anthracnose 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3567.10—2017 前言 SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为11个部分： 第1部分：通用技术规程； 第2部分：霍乱弧菌； 第3部分：大肠杆菌O157：H7； 第4部分：黄热病毒； 第5部分：沙门菌属； 第6部分：结核分枝杆菌； 第7部分：肠道病毒71型； 第8部分：症原虫； -第9部分：鼠疫耶尔森菌； 第10部分：炭疽芽孢杆菌； 一第11部分：志贺菌。 本部分为SN/T3567的第10部分。 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫 局、杭州优思达生物技术有限公司。 本部分主要起草人：王馨、翰文东、赵辉、原静、李浩辰、祁军、胡林、其敏。 SN/T3567.10—2017 交叉引物恒温扩增检测方法 第10部分：炭疽芽孢杆菌 1范围 SN/T3567的本部分规定了国境口岸炭疽芽孢杆菌交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程序及 检测结果的报告。 本部分适用于炭疽芽孢杆菌筛查检测，以及对国境口岸感染炭疽芽孢杆菌或疑似被炭疽芽孢杆菌 污染的物品实验室检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1214—2003国境口岸处理炭疽杆菌污染可疑物品操作规程 SN/T2358—2009国境口岸炭疽芽孢杆菌荧光定量PCR检测方法 人间传染的病原微生物名录（卫生部2006） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 交叉引物恒温扩增技术crossingprimingisothermalamplification，CPA 一种核酸恒温扩增技术，CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶（DNAPoly merase)外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的 高活性的链置换特性，使脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid,DNA）的循环扩增能不断的实现。 3.2 交叉引物 crossingprimer 用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5'末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物 的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引人对方的杂交序列， 增加引物的杂交位点，促进扩增反应。 3.3 剥离引物 bumperprimer 位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸 链从模板上剥离。 3.4 检测引物 detectionprimer 一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标 1 SN/T3567.10—2017 记，以用于检测。 3.5 BstDNA聚合酶BstDNApolymerase 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的部分片段，保留了其5'-→+3"DNA 聚合酶活性，但是去除了5"-→3"核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换 功能（StrandDisplacement)。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） 5生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，按照GB19489和原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》 （2006)中的有关规定，应由具备相关资格的工作人员进行实验操作。所有废弃物也应按照GB19489 中的有关规定执行。 6检测对象 6.1 炭疽芽孢杆菌菌株。 6.2 疑似感染炭疽芽孢杆菌的病人和被污染物品。 7 试剂和材料 7.1 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水 7.2DNA提取试剂：5%Chelex水溶液或细菌基因组DNA提取试剂盒。 7.310XThermoPol缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/L(NH.),SO:、100mmol/L KCl、20mmol/LMgSO,1%TritonX-100。 7.410mmol/LdNTPs溶液：dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L。 7.5 BstDNA聚合酶：8U/μl。 7.6 甜菜碱溶液：5mol/L。 7.7 MgS，溶液：100mmol/L。 7.8阳性对照：含有目的片段的质粒DNA， 7.9 阴性对照：DNA提取试剂。 7.10 TE缓冲液（pH7.4)：0.1mol/LTris-HCI（pH7.2)20ml.加人0.5mol/1.EDTA(pH8.0) 4.0mL，用超纯水定容至200ml。高压灭菌后4℃保存。 7.11 12%琼脂糖凝胶。 7.12 2Goldvicw:0.5μg/μl.。 2 SN/T3567.10—2017 7.13DNA分子标记物。 7.14 引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。参见附录A。 7.15 封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）：使用方法参见附录B。 8 仪器设备 8.1 任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。 8.2 8.3 计时器。 超净工作台。 8.5 生物安全柜。 8.6 消毒灭菌锅。 8.7 高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。 8.8 台式离心机（最高离心力2000g以上）。 8.9 涡旋振荡器。 8.10 低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。 8.11 紫外凝胶电泳图像分析系统。 9 炭疽芽孢杆菌交叉引物恒温扩增法检测程序 9.1 样品采集和处理 按照SN/T2358—2009、SN/T1214一2003执行样本采集和处理。 9.2 2模板DNA提取 9.2.1煮沸法 按照SN/T2358--2009进行DNA提取。 9.2.2试剂盒提取 按适用于炭疽芽孢杆菌基因组提取的试剂盒说明书操作。 9.3 交叉引物恒温扩增 9.3.1交叉引物恒温扩增引物 用于检测炭疽芽孢杆菌的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。 9.3.2阳性对照、阴性对照和空白对照设置 实验过程中需要分别设阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照采用含检测序列的质粒DNA作 荫水作为交叉引物恒温扩增模板。 9.3.3交叉引物恒温扩增反应体系 交叉引物恒温扩增反应检测炭疽芽孢杆菌的参考反应体系见表1。 3