SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3567.82017 交叉引物恒温扩增检测方法 第8部分：疮原虫 Detection method of crossing priming isothermal amplification- Part8:Plasmodium 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3567.8—2017 前言 SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为11个部分： 第1部分：通用技术规程； -第2部分：霍乱弧菌； 第3部分：大肠杆菌O157：H7； 第4部分：黄热病毒； 第5部分：沙门菌属； -第6部分：结核分枝杆菌； 第7部分：肠道病毒71型； 第8部分：原虫； 第9部分：鼠疫耶尔森菌； 一第10部分：炭疽芽孢杆菌； 第11部分：志贺菌。 本部分为SN/T3567的第8部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：天津国际旅行卫生保健中心、杭州优思达生物技术有限公司。 本部分主要起草人：左锋、关淳、赵欣、祁军、胡林、尤其敏。 SN/T3567.8—2017 交叉引物恒温扩增检测方法 第8部分：疮原虫 1范围 SN/T3567的本部分规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测疟原虫的检测对象、检测程 序及检测结果报告。 本部分适用于在国境口岸对原虫的快速筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T3562国境口岸原虫PCR检测方法 人间传染的病原微生物名录（卫生部2006） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 交叉引物恒温扩增技术crossingprimingisothermalamplification；CPA merase)外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的 高活性的链置换特性，使脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid,DNA)的循环扩增能不断的实现。 3.2 交叉引物crossingprimer 用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5'末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物 的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引人对方的杂交序列. 增加引物的杂交位点，促进扩增反应。 3.3 剥离引物bumperprimer 位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸 链从模板上剥离。 3.4 检测引物 detection primer 一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标 记，以用于检测。 SN/T3567.8—2017 3.5 BstDNA聚合酶BstDNApolymerase 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的部分片段，保留了其5'→+3"DNA 聚合酶活性，但是去除了5→3'核酸外切酶活性。Bst DNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换 功能（StrandDisplacement)。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） 5 生物安全措施 实验操作及处理按照GB19489和原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定， 由具备相关资质的工作人员进行。 6检测对象 6.1 疑似感染症原虫的血液标本。 6.2来自症疾流行区的蚊虫标本。 7 试剂和材料 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。 7.1J DNA提取试剂：5%Chelex水溶液或细菌基因组DNA提取试剂盒。 7.210XThermoPol缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/L(NH,)2SO:、100mmol/L KCl、20mmol/LMgSO,、1%TritonX-100。 7.3 310mmol/LdNTPs溶液：dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L.。 7.41 BstDNA聚合酶：8U/μl。 7.5 甜莱碱溶液：5mol/L。 7.6 MgSO.溶液：100mmol/L 7.7 阳性对照：含有目的片段的质粒DNA。 7.8 阴性对照：DNA提取试剂。 7.9 引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。参见附录A。 7.10 封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条），装置使用方法参见附录B。 8 仪器设备 8.1↑ 任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪 2 SN/T3567.8—2017 8.2 微量移液器：量程范围为0.1μL~2μl;0.5μ~10μL；10μ~100μL100μ~1000μ。 8.3 计时器。 8.4 超净工作台。 8.5 生物安全柜。 8.6 消毒灭菌锅。 8.7 高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。 8.8 台式离心机（最高离心力2000g以上）。 8.9 涡旋振荡器。 8.10 低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。 8.11 紫外凝胶电泳图像分析系统。 9 检测程序 9.1 样本的采集 样本采集按照SN/T3562执行。 9.2 蚊虫样本前处理 将待检蚊虫标本每组分别用含青霉素（1000U/mL）、链霉素（1000U/mL）的无菌生理盐水清洗 三次，每组蚊样加人2.0mLHanks液，在组织研磨器中研磨或电动匀浆机中匀浆20s～30s，使样本 匀浆成糊状，12000r/min离心3min，取上清液作为样本。 9.3模板DNA提取 从血样本和蚊虫样本中提取DNA按照SN/T3562执行。 9.4交叉引物恒温扩增 9.4.1 扩增引物 用于检测症原虫的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。 9.4.2 2阳性对照、阴性对照和空白对照设置 实验过程中需要分别设阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照采用含检测序列的质粒DNA作 为交叉引物恒温扩增模板；阴性对照以DNA提取液代替交叉引物恒温扩增模板；空白对照则采用无菌 水作为交叉引物恒温扩增模板。 9.4.3 交叉引物恒温扩增反应体系 交叉引物恒温扩增反应检测症原虫的参考反应体系见表1。 表1症原虫交叉引物恒温扩增参考反应体系 试剂名称 储备液浓度 20体系加样量 2 μl, 10 mmol/L dNTPs 10 mmol/1. 0.8 μal. 制离引物F和B 20 μmol/L. 各0.1 μl, 3