SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3731.4—2017 代替SN/T3731.4—2013 食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第4部分：火鸡成分检测 实时荧光PCR法 Identification of poultry ingredient in food and feed- Part 4:Detection of turkey ingredientReal-timePCRmethod 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3731.4—2017 前言 SN/T3731《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法》共分为以下6个部分： 第1部分：鹑成分检测 PCR法； PCR法； 第2部分：鹅成分检测 第3部分：鸽子成分检测 实时荧光PCR法； 一第4部分：火鸡成分检测 实时荧光PCR法； 第5部分：鸭成分检测 PCR法； 第6部分：鹧鸪成分检测 实时荧光PCR法。 本部分为SN/T3731的第4部分。 本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本部分与SN/T3731.4一2013相比，主要技术变化如下： 检测用引物和探针序列。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：张舒亚、吕蓉、谌鸿超、韩建勋、刘月明、褚庆华、陈颖、吴亚君。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T3731.4-2013。 I SN/T3731.4—2017 食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第4部分：火鸡成分检测 实时荧光PCR法 范围 SN/T3731的本部分规定了食品和饲料中火鸡成分的实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于食品和饲料中火鸡成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 火鸡turkey 属雉科（Phasianidae）火鸡属（Meleagris），学名Meleagrisgallopavo。 3.2 实时荧光PCR realtimePCR 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.3 Ct值cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） DNA：脱氧核糖核酸(DeoxyribonuleicAcid) dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphate） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrithylammoniumBromide） Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)Aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiaminetetraaceticAcid) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） 1 SN/T 3731.4—2017 OD：光密度值（OpticalDensity） 5方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用火鸡的12SrRNA基因特异性检测引物和探针进 行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，判断样品中是否存在火鸡成分。 6 试剂和材料 6.1 检测用引物和探针 检测用引物和探针见表1。 表 1 名称 序列(5'-3') 目的基因 火鸡成分5'端引物 GCCCTAACCCCTTAAGAAAAGAAT 火鸡成分3'端引物 AGTTGCTATGGCTAAGTCAAGTTTACAC 火鸡12SrRNA基因 火鸡成分探针 FAM-CTTGCTTGAGCCACACC-MGB 6.2试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 6.2.1CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB，1.4mol/LNaCI溶液，0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/L NazEDTA,pH 8.0。 6.2.2 CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCI溶液。 6.2.3 蛋白酶K溶液（20mg/mL）。 6.2.4 NaCl溶液(1.2mol/L)。 6.2.5 三氯甲烷(氯仿）。 6.2.6 异丙醇。 6.2.7 70%乙醇。 6.2.8 TE缓冲液（Tris-Cl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCI(pH8.0），1mmol/LEDTA (pH 8.0)。 6.2.9 实时荧光PCR反应混合液：12.5uL反应体系包括：1U~2U的Taq酶、1XPCR缓冲液、 2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d（A，C,G)TPs、 0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）。如果 具有等效的商品化试剂盒，则可使用这些等效产品。 7 仪器设备 7.1 实时荧光PCR仪。 7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.3 恒温水浴锅。 7.4 离心机：最大离心力要超过12000g。 2 SN/T·3731.4—2017 7.5微量移液器（2.5μL，20μL,200μL，1000μL)。 7.6研钵及粉碎装置。 7.7涡旋振荡器。 7.8pH计。 7.9天平：感量0.01g。 8检验步骤 8.1·DNA提取 将样品研磨后，称取200mg左右固体样品或200μL液体样品于2mL离心管中，加人1.5mL CTAB提取缓冲液和10μL蛋白酶K溶液。60℃振荡过夜后13000g离心10min，转移上清液到新 的离心管中。加入750μL氯仿后用力振荡，13000g离心5min，将上清液转移到新的离心管中。加 人2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60min，13000g离心15min，弃去上清液。加人350μL NaCl溶液将沉淀进行悬浮。再加人350μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min。转移上清 液后加人0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清液。加 人500μL70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200μLTE溶液中。立即使用或一20℃保存备用。也可用 等效的DNA提取方法提取模板DNA。 8.2DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。 DNA的浓度按照式（1)计算，当A260/A28比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增： c=AXNX50/1000 .(1) 式中： DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）； C A——260nm处的吸光值； N—核酸稀释倍数。 8.3实时荧光PCR扩增 8.3.1反应体系的体积为25μL：实时荧光PCR混合液12.5μL、正反向引物(10umoi/L)各1μL、探针 (10μmol/L)1μL、模板DNA5μL，水补足至25μL。 8.3.2实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为：50℃2min;95℃10min；95℃15s， 60℃1min，40个循环。 8.3.3每个样品设置两个平行的反应体系。检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。 用已知含火鸡成分的样品作阳性对照，用已知不含火鸡成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替 模板DNA作空白对照。 9质量控制 以下条件有一条不满足时，实验视为无效： 空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值=40.0； a): 阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值=40.0； c) 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。 3 SN/T3731.4—2017 10 . 结果判断与表述 10.1 结果判定 在符合第9章的情况下，被检样品进行检测时： a) 如Ct值≤35.0，则判定位被检样品阳性，扩增靶标序列参见附录A； b） 如Ct值≥40.0，则判定位被检样品阴性； c）如35.0<Ct值<40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为<40.0，则判定被检样品阳性。 如再次扩增后Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性。 10.2 结果表述 10.2.1结果为阳性，表述为“检出火鸡成分”。 10.2.2 结果为阴性，表述为“未检出火鸡成分” 11 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T27403执行。 检出限 本方法的最低检出限为0.1g/kg。 SN/T 3731.42017 附录A （资料性附录） 火鸡成分12SrRNA基因扩增参考序列（Genbank序列号JF275060.1) 火鸡成分12SrRNA基因扩增参考序列(Genbank序列号JF275060.1)为 ttcagcagtaattaaccttaagcaataagtgtaaacttgacttagccatagcaact. 5