SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4799-2017 动物结核病病原菌检测方法 变性高效液相色谱法 Detection of tuberculosis pathogenic organisms of animals- DHPLC method 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 动物结核病病原菌检测方法 变性高效液相色谱法 SN/T 4799--2017 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029) 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：（010)68533533 网jJ:www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数18千字 2018年6月第一版 反2018年6月第一次印刷 印数1-500 号：155066·2-33414 定价16.00 0元 SN/T4799—2017 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局 本标准主要起草人：刘志玲、陈茹、王莹、吴晓薇、朱道中、段燕喻、林志雄。 SN/T4799—2017 动物结核病病原菌检测方法 变性高效液相色谱法 1范围 (mPCR-DHPLC)检测方法的技术要求和操作规范。 本标准适用于快速检测细菌培养物、动物组织、血样、痰液等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核 分枝杆菌、牛分枝杆菌。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DHPLC：变性高效液相色谱（denaturinghigh-performanceliquidchromatography）。 dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonuclesosdetriphosphate）。 PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）。 mPCR：多重聚合酶链式反应（multiplex-polymerasechainreaction）。 TEAA：三乙基铵醋酸盐。 4概述 人与动物结核病涉及多种病原菌或病原菌复合群。结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuber culosiscomplex；MTC)是感染人与哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌、非洲分 枝杆菌和田鼠分枝杆菌。其中，主要感染人与家畜并致病的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。与MTC 相对应的是种类繁多的各种非结核分枝杆菌（NTM）。NTM感染患者的临床症状及病理变化与MTC 引起的结核病极为相似，但多数NTM对抗结核药物有天然耐药性。此外，NTM感染可造成结核菌素 皮内变态反应或血清学检测假阳性。采用多重PCR联合变性高效液相色谱检测的方法可同步区分结 核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复核群，并鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌 mPCR反应的原理、操作过程与普通PCR相同。在同一PCR反应体系里加人多对特异性引物，对 多个DNA模板或同一模版不同区域扩增出多个目的DNA片段。DHPLC分析技术是利用液相色谱 技术，在高压闭合液相流路中，将DNA样品自动注人并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，DNA片段 分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA 分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙的梯度 洗脱将不同大小的DNA片段分离。由紫外或荧光检测被分离的DNA样品。根据DNA扩增片段长 1 SN/T4799-2017 度大小，不同分子量的特异扩增产物在特定位置呈现吸收峰，从而对结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆 菌和牛分枝杆菌进行快速检测。 5材料与试剂 5.1 仪器与耗材 5.1.1 变性高效液相色谱分析仪。 5.1.2 核酸扩增仪。 5.1.3 Ⅱ级生物安全柜。 5.1.4 接种棒。 5.1.5 恒温水浴锅（室温至100℃） 5.1.6 离心机。 5.1.7 微量可调移液器和灭菌吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL 5.1.8 天平。 5.1.9 PCR光学反应管。 5.2 试剂 5.2.1 试剂级别：除另有规定，所用化学试剂均为分析纯 5.2.2 检测用引物：见表1。 表1分枝杆菌PCR-DHPLC检测扩增引物序列 目标菌类 目标基因 核酸序列（5#-3） 产物大小 结核分枝杆 上游引物：CCAACAAGAAGGCGTACTC 165 bp IS6110 菌复合群 下游引物：TTGATCGTCTCGGCTAGTG 上游引物：CGATGAGCGGTCCAATC 380 bp 结核分枝杆菌复合群 IS1081 下游引物GACGCGGCCTGCCT 上游引物：AAGCGATTCTGCGACATATTC 结核分枝杆菌 MTss127 213 bp 下游引物：GTGAACGGAAGCGGATTTG 上游引物TCTTGGAGTGGCCTACAAC MBss229 241 bp 牛分枝杆荫 下游引物：GCGAACAGATTCAGCATGG 采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物（序列见表1)配制成100μmol/L储存液，置一20℃或更 低温度冻存；使用时取适量配制成10umol/L工作液，避免多次冻融。 5.2.30.01mol/LPBS(pH7.6)：配方见附录A中A.1。 5.2.4柠檬酸钠缓冲液：配方见A.2。 5.2.50.5mol/LEDTA(pH8.0）：配方见A.3。 5.2.62 柠檬酸钠-磷酸缓冲液：配方见A.4。 5.2.7 4%氢氧化钠溶液：配方见A.5。 5.2.8 Triton X-100。 5.2.9 DNA提取液：含100mmol/I.Tris-HCl(pH8.0），0.01%TritonX-100，20μg/μl蛋白酶K。 5.2.10 灭菌双燕水。 2 SN/T4799—2017 5.2.11三氯甲烷。 5.2.12dNTPs: dATP、dTTP、dCTP和 dGTP。 5.2.13TaqDNA聚合酶。 5.2.14DHPLC缓冲液：配方见A.6。 6生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489的有关规定。 7样品采集与前处理 7.1培养物 直接取液体培养基培养的菌液；对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量（取用量达到 肉眼可见，菌团大小不超过接种环）菌样，放到1mL0.01mol/LpH7.6PBS中，振荡混匀形成悬浮 菌液。 取1mL菌液样品，15000×g离心10min.弃上清，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS，充分振荡混 匀，15000×g离心10min；弃上清，收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或置一20℃贮存备用。 7.2全血、血清 用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血。将血液直接滴天抗凝剂中，并立即连续摇动， 充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。条件允 许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。 取1mL~2ml全血样品，15000×g离心10min，弃上清：加等体积灭菌双蒸水充分振荡， 15000×g离心10min；弃上清，若红血球裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，按8.1 进行核酸提取，或置一20℃贮存备用。 血清样品处理方法同7.1。 7.3痰液 动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰 液。亦可取咳出的痰块。 在痰液样品中加人2～4倍体积4%氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置30min，间或振荡混匀，使 其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加人少量 4%氢氧化钠溶液直至液化完全）；15000×g离心10min；弃上清，加1ml.0.01mol/LpH7.6PBS，充 分振荡混勾，15000×g离心10min，弃上清，重复本步骤1次；收集沉淀物，按8.1进行核酸提取，或 置一20℃贮存备用。 7.4组织器官 采集动物下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织 器官如肝、脾、肺等。 取适量组织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按1：5的比例加人柠檬酸钠-磷酸缓冲液（例，1g组织样 品，加人5mL缓冲液），充分研磨；加等量4%氢氧化钠溶液，继续研磨5min～10min，使组织液化；移 入离心管，充分振荡，75℃水浴0.5h～1h；取上清（避免吸取粗渣），15000×g离心10min；弃上清， 加等量0.01mol/LpH7.6PBS，振荡混勾，使沉淀充分恐浮，15000×g离心10min，弃上清，重复本步 3