SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4808-2017 进出口食用动物、饲料中磺胺类 药物的测定 酶联免疫吸附法 Detection of sulfonamide residues in live animals and feeds for import and exportEnzyme linked immunosorbent assay method 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 48082017 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：闫超杰、姚佳、张旭东、苏明明、肖姗娜、孙剑、丁艳、刘芳伊。 SN/T4808—2017 进出口食用动物、饲料中磺胺类 药物的测定酶联免疫吸附法 1范围 本标准规定了进出口食用动物的血清、尿液及饲料中九种磺胺类药物残留量的酶联免疫测定方法。 本标准适用于禽类和畜类血清、畜类尿液及饲料中磺胺甲恶唑、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹恶 啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪9种磺胺类药物总量的 测定。本标准仅适用于出人境检验检疫工作。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法原理与提要 采用竞争性酶联反应原理，微孔板上包被着抗磺胺类药物抗体的捕获抗体。磺胺类药物标准品或 者样品溶液、HRP标记的磺胺类药物和抗磺胺类药物抗体添加到孔中。游离的磺胺类药物和HRP标 记的磺胺类药物竞争结合磺胺类药物抗体，同时板上包被捕获抗体被抑制。没有结合的HRP标记的 磺胺类药物在洗板步骤中被洗去。TMB底物加入板孔中，底物的颜色显色强度与样品中磺胺类药物 的含量成反比。 4试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，或为更高级别。水为GB/T6682规定的二级水。 4.1磺胺类药物多残留快速检测试剂盒，试剂盒应在4℃～8℃条件下避光保存。 4.1.196孔酶标板（可拆式）。 HRP偶联磺胺类药物。 4.1.2 4.1.3 抗体工作液。 4.1.4 TMB底物溶液。 4.1.5 反应终止液。 4.1.6 10×样品提取液F：使用时按1：9的比例用蒸馏水稀释成1×样品提取液F。 4.1.7 20×浓缩洗液：使用时按1：19的比例用蒸馏水稀释成1×工作洗液。 4.1.8 组织提取液：将浓缩组织提取液加入180mL蒸馏水，混匀完全溶解后即为组织提取液。 4.1.9 组织纯化试剂。 1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实 验评估使用这些等效产品， 1 SN/T4808—2017 4.2 甲醇。 4.3 乙腈。 4.4 磷酸氢二钠(Na2HPO·12H2O)。 4.5 磷酸二氢钾（KH2PO:）。 4.6 氯化钠。 4.7 氯化钾。 4.8 标准品：包括磺胺甲恶唑、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺 间二甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺氮哒嗪九种标准品，纯度≥99%。参见附录A。 4.97 标准品储备溶液：将磺胺药物标准品配制成10mg/L甲醇储备溶液，一20℃保存，有效期6个月。 4.100.01mol/L磷酸盐（PBS)缓冲溶液(pH=7.4)：称取_8.0gNaCl,0.2gKCl,0.24gKHzPO；和 3.63gNa2HPO:，溶于800mL蒸馏水中，用HCI调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。 冰箱4℃保存。 5仪器和设备 5.1 粉碎机。 5.2 均质器。 5.3 天平（精确到0.001g）。 5.4 漩涡混合器。 5.5 离心机（3000×g以上）。 5.6 水浴氮吹仪。 5.7 酶标仪：测定波长450nm。 5.8 洗板机。 5.9 单道微量加样器：20μL，100L.200mL，1000L 5.10 多通道微量加样器：200叫L 6测定步骤 6.1试样制备和保存 6.1.1试样制备 分别取食用活动物的血液100ml、新鲜尿液样品约500g或500mL，均质饲料样品500g，充分混 匀，将样品分成两等份，装人洁净容器内，作为试样密封并标明标记。血液样本在保存前应制备成血。 清，全血样本置于室温放置2h或4℃过夜后大于3000r/min离心10min，取上清液即为血清。 6.1.2试样保存 将试样于一18℃以下冷冻保存，在制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的 变化。 6.2提取 6.2.1饲料 称取1.0g精确到0.01g)均质饲料样品，加人6ml.乙腊和2ml.组织提取液，最大速度涡旋振荡 3min，4000r/min以上离心10min；移取3ml上清液到干净的离心管中，加人150mg组织纯化试 SN/T4808—2017 剂，涡旋振荡30s，室温下静置5min，4000r/min以上离心10min；移取600μL上清液到干净离心管 中，50℃～60℃水浴氮气吹干，加入500μL1×样品提取液F，涡旋振荡30s，每孔取50μL用于检测。 6.2.2血清 取0.5mL血清到离心管中，4000r/min以上离心10min，取20μL上清液，加入80μL1×样品提 取液F，混匀稀释后每孔取50μL用于检测。 6.2.3尿液 取0.5mL尿液到离心管中，4000r/min以上离心10min，取20μL上清液，加人80μL1×样品提 取液F，混匀稀释后每孔取50μL用于检测。 6.3酶联免疫测定 6.3.1标准曲线的制备 用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释10mg/L的磺胺药物标准溶液贮备液至100μg/L，用PBS对 100μg/L的磺胺药物标准溶液进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的磺胺药物标准溶液（50μg/L， 20μg/L,15μg/L,5.0μg/L,1.5μg/L0.5μg/L) 6.3.2样品测定 在酶标板设定的孔中分别加人50L不同浓度的磺胺药物标准溶液和样品待测液；在空白和对照 孔中分别加人50μL的水除空白孔外，在每个孔中分别加人50μLHRP偶联磺胺类药物和50μL磺 胺药物抗体；空白孔中则加人100μL磷酸盐缓冲液；轻拍混勾，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，室温 孵育60min。弃掉酶标板中的液体，用洗液洗板3次，每次每孔应加入250μL1×工作洗液。加人 100μLTMB底物，轻轻混匀，室温放置30min后，每个孔加人100μL的反应终止液终止反应，轻轻混 匀，稳定2min后，10min内在450nm下读出每孔吸光值。 6.3.3空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行 6.3.4质控试验 每次测定均应用空白试验、阴性样品和阳性样品作为对照进行质量控制，阳性样品的添加浓度应为 相应样品的定量限。 6.4结果计算 6.4.1百分吸光度值的计算 按式（1)计算百分吸光度值： .(1) Be 式中： B品 样品孔的平均吸光度值； 空白孔的平均吸光度值； B, 零标准的平均吸光度值。 3