SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T48072017 进出口食用动物、饲料中杆菌肽的 检测方法 Determination of bacitracin in animals and feeds for import and export 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4807—2017 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局 本标准主要起草人：张晓文、张晓梅、郑小龙、刘靖靖、王凤美、王群、王培峰、张金玲。 SN/T48072017 进出口食用动物、饲料中杆菌肽的 检测方法 1范围 本标准第一法规定了进出口食用动物血液和饲料中杆菌肽A的液相色谱串联质谱测定方法，第二 法规定了进出口 本标准适月 本标准适月 2规范性引用 下列文件双 件。凡是不注日 GB/T668 第一法 3方法提要 试样经粉碎、均质后，用甲醇-甲酸水溶液提取样品中的杆菌肽A残留用固相萃取小柱净化，液相 色谱-串联质谱测定，外标法定量。 4试剂 除非另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一 4.1 二氟乙酸。 EDTA。 4.2 4.3 TCA。 4.4 甲醇：色谱纯。 4.5 乙腈：色谱纯。 4.6 甲酸：色谱纯。 4.7 1.5mmol/LEDTA溶液：称取0.5gEDTA于容量瓶中，加水定容至1000mL。 4.8 1%TCA溶液：称取10.0gTCA于容量瓶中，加水定容至1000mL。 4.9 0.1%的甲酸-水溶液：移取1mL甲酸于容量瓶中，加水定容至1000mL。 4.10 4%三氯乙酸-乙腈溶液：移取4mL二氯乙酸于容量瓶中，乙腈定容至100mL。 4.11 定容液：0.1%甲酸-水溶液利乙腈体积比为8：2。 4.12 杆菌肽A标准品：纯度≥96.0%。 4.13 标准储备液：准确称取杆菌肽标准品，用甲醇（4.3）溶解定容至10mL，溶液浓度为1000μg/mL。 1 SN/T4807—2017 此储备液可在一18℃以下避光存放12个月。 4.14标准中间液：准确吸取杆菌肽A标准储备液500μL甲醇定容至10mL，配置浓度为50μg/mL 的标准中间液，此中间液可在一18℃以下避光存放6个月。 4.15 5标准工作液：将杆菌肽A中间液用0.1mol/L甲酸稀释至1μg/mL，现用现配。 4.16基质标准工作液。 4.17[ 固相萃取柱：亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共 聚物。 4.18 BEHC18:1.7μm,50mmX2.1mm。 4.19 滤膜：0.22μm。 5仪器 5.1 液相色谱-串联质谱仪液相色谱：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2 高速冷冻离心机。 5.3 高速组织捣碎机。 5.4 氮气浓缩装置。 5.5 快速混匀器。 5.6 移液器：0.1mL,0.2mL,1.0mL,5.0mL。 5.7 均质器。 5.8 分析天平：感量为0.01g和0.01mg。 5.9 4.17同相萃取柱：60mg。 5.10 聚四氟乙烯离心管：50mL。 5.11 进样瓶：1.5mL。 5.12 基本型水平振荡器。 5.13 超声波仪。 5.14 一次性注射式滤器：配有0.2μm微孔滤膜。 6 分析步骤 6.1 制备与保存 6.1.1 血液的制备和保存 无菌采集静脉血10mL放于含有抗凝血剂的试管中，一18℃以下长期保存。 6.1.2饲料样品制备和保存 从所取原始样品中取出部分有代表性样品，经高速组织捣碎机捣碎，用四分法缩分出不少于500g 试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后作出标记，一份作试样，一份作留样。样品于一18℃保存。 6.2 分析步骤 6.2.1提取 6.2.1.1血液 准确称取（1.0士0.01）g试样，置于50mL具塞塑料离心管中，加人5mLEDTA溶液和5mLTCA 2 SN/T4807—2017 溶液，振荡混匀，加入4%三氯乙酸乙腈溶液2mL，混匀，超声波超声5min，4000r/min离心10min， 取上清液至另一50mL离心管中，样品残渣再加人10mL甲醇一0.1%甲酸水溶液（体积比2：5）提取 液重复提取1次，合并上清液于50mL离心管，待用。 6.2.1.2 饲料 准确称取（5.0士0.01)g试样，置于50mL具塞塑料离心管中，加入10mLEDTA溶液和10mL TCA溶液，振荡15min，4000r/min离心10min，取上清液至另一50mL离心管中，样品残渣再加人 待用。 6.2.2 净化 将待净化液体过固相萃取小柱（4.17)（60mg）固相萃取柱净化。固相萃取柱依次用3mL甲醇、水 预活化，上样，10mL水淋洗，5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，40℃下氮吹至干，用定容液 1mL复溶，混匀，过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。 6.3 仪器参数与测定 6.3.1 液相色谱条件 液相色谱条件如下： 色谱杜：BEHCi8，1.7μm，50mmX2.1mm，或相当者； a) b) 柱温：30℃； c) 流动相：A：0.1%甲酸，B：乙腈；梯度洗脱程序见表1； 表1 梯度洗脱程序表 时间 0.1%甲酸 乙腈 曲线变化模式 min % % 0 90 10 6 4 10 90 6 7 10 90 6 7.1 90 10 6 10 06 10 1 d) 流速：0.2mL/min； e) 进样量：15μL。 6.3.2 质谱条件 质谱条件如下： a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：止离子模式； c) 检测方式：选择反应监测（SRM)； d) 喷雾电压：ESI(1)：4500V； e) 鞘气压力：241.3kPa； f) 辅助气压力：13.8kPa。 g) 定性离子对、定量离子对和碰撞能量，见表2。 3 SN/T4807—2017 表2 杆菌肽A定性离子对、定量离子对和碰撞能量 碰撞能量 化合物名称 定性离子对 定量离子对 V 杆菌肽A 475.4/199.1 475.4/199.1 0.1 28 475.4/110.2 54 475.4/86.3 24 6.3.3 3液相色谱-串联质谱测定 的响 谱条 6.3.4 溶液 准溶 ±20% ±25% ±50% 允许的相对偏差 ±303 6.4 空白试验 除不加试样外，均按照上述测定步骤进行 行。 结果计算 7 外标法定量，试样中被测组分残留量按式（1）计算 1000 X=cX X ..(1) 1000 m 式中： X 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； C V 试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）； 试样溶液所代表的质量，单位为克（g）。 注：计算结果应扣除空白值。 8方法性能指标 8.1定量限 血液和饲料中杆菌肽A的测定低限均为50μg/kg。 SN/T4807-2017 8.2回收率 称取血液样品或饲料样品阴性控制样品，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，用与样品相同的方法 进行处理。杆菌肽测定回收率范围见表4。 过滤，备用。 11.2血液样品：移取1mL血清，加人2mL70%甲醇溶液，强力震荡3min，用0.22μL过滤，备用。 一18℃以下长期保存。 12 仪器与设备 波长450nm酶标仪，震荡器，冰箱，温箱，8道或12道洗头洗板机，8道或12道移液器（10μL~ 100μL）各个规格微量移液器，Eppendorf管。 13 试剂准备 试剂盒各组分在使用前恢复至室温（20℃~25℃）；样本稀释液：用蒸馏水10倍稀释；浓缩洗涤液 5