SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4816—2017 进出口食用动物中磺胺类药物残留量的 测定氵 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of sulfonamides residues in live animals for import and export-LC-MS/MS 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4816—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任， 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：姚佳、张旭东、苏明明、闫超杰、孙兴权、孙剑、丁艳、刘芳伊。 - SN/T4816—2017 进出口食用动物中磺胺类药物残留量的 测定液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了进出口食用动物的血清、尿液中共计14种磺胺药物残留量高效液相色谱-质谱/质谱 测定方法。 本标准适用于禽类和畜类动物血清，畜类动物尿液的磺胺间二甲氧基啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺 胺喹恶啉、三甲氧芋胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺二甲 基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基异唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 血清中磺胺类药物用乙睛和乙酸乙酯提取，尿液中磺胺类药物用乙酸乙酯提取，经乙饱和的正已 烷脱脂净化，用HPLC-MS/MS检测，外标法定量。 4试剂和材料 4.1 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一一级水。 4.2 乙睛：色谱纯。 4.3 乙酸乙酯：色谱纯。 4.4 正已烷：色谱纯。 4.5 氯化钠：分析纯。 4.6 甲酸：色谱纯。 0.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸（4.6），用水稀释并定容至1000mL，混勾。 4.8 乙睛饱和的正已烷：200mL正已烷中加入40mL乙腈，充分震摇，静置分层后待用。 4.9 4.10标准物质：磺胺间二甲氧基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、三甲氧苄胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、 磺胺甲氧哒嗪、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲 基异嗯唑、磺胺嘧啶、磺胺吡啶，纯度大于或等于99%。 4.11标准储备溶液（100μg/mL）：准确称取各磺胺标准品10mg，分别置于100mL容量瓶中，甲醇溶 解，定容至刻度，摇匀，得磺胺各标准储备液。每种磺胺标准品的浓度为100μg/mL，1℃～4℃冰箱保 存，有效期1个月。 1 SN/T4816—2017 浓度（ng/mL）的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作液在1℃～4℃冰箱保存，可使用两周。 5仪器和设备 5.1 高效液相色谱串联二级质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。 5.2 均质器。 5.3 旋转蒸发器。 5.4 氮吹仪。 5.5 涡旋混均器。 5.6 分析天平：感量0.1mg和0.01g各台。 5.7 真空泵。 5.8 离心机。 5.9 超纯水机。 5.10 0.22μm有机相微孔滤膜。 6试样制备与保存 6.1试样制备 将采集的血液置于未加抗凝剂处理的试管中，避光静置过夜，离心，上清液为血清，将血清用无菌容 器分装，做好标签。尿液样品装人洁净的容器中加封做好标签。制样过程中应防止试样受到微生物及 化学物的污染或发生残留变化。 6.2试样保存 血清样品于-5℃～-2℃条件下保存，尿液样品于-20℃～-18℃条件下保存。 7测定步骤 7.1提取和净化 7.1.1血清：移取试样1mL或称取试样1g（精确至0.1g），置于50mL塑料离心管中，加人1mL水 和0.6g氯化钠，混匀。加人乙腈4mL，摇匀，再加入11mL乙酸乙酯，充分涡旋提取，8000r/min离 心5min。准确移取8mL上清液置于鸡心瓶中，38℃水浴中减压浓缩至近干。加入1mL流动相 （0.1%甲酸：乙腈为76：24)溶解残渣，再加1mL乙腈饱和的正已烷，振摇，溶液转移至玻璃离心管 中，3000r/min离心5min，移取下清液过微孔滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。 7.1.2尿：移取试样1mL或称取试样1g（精确至0.1g），置于50mL塑料离心管中，加人1mL水和 2.5g氯化钠，混匀，加人15mL乙酸乙酯，充分涡旋提取，8000r/min离心5min。准确移取8mL上 清液置于鸡心瓶中，38℃水浴中减压浓缩至近干。加人1mL流动相(0.1%甲酸：乙腈为76：24)溶解 清液过微孔滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。 7.2 测定条件 7.2.1 液相色谱条件 液相色谱条件： 2 SN/T 4816—2017 a) 色谱柱：C18，150mmX3.0mm（内径），粒度：3.5μm；或相当者； b) 流动相：A一0.1%甲酸，B一乙腈，梯度洗脱，洗脱条件见表1； c) 流速：0.3mL/min; (P 色谱柱温度：35℃； e) 进样量：10μL。 表1流动相及梯度洗脱条件 时间/min 流动相A 流动相B 0.0 76 24 0.3 76 24 8.5 55 45 8.51 20 80 9.5 20 80 9.51 76 24 14.0 76 24 7.2.2 质谱条件 质谱条件： a) 离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式； b) 检测方式：多重反应检测(MRM)； 其他质谱参考条件参见附录A； c) d) 定性离子对、定量离子对、驻留时间（Dwelltime）、去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）、碰撞室出口 电压(CXP)及摄人电压(V)等参数见表A.1。 7.2.3 定量测定 类药物残留的响应值均应在仪器线性范围内，对基质工作溶液和样液等体积参插进样。标准溶液的液 相色谱-质谱/质谱多反应检测（MRM)色谱图参见附录B。 7.2.4 定性标准 按照上述仪器条件测定样品和标准工作溶液，样品中目标物质的保留时间与标准溶液中目标物的 相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判定样品中存在相应的被测物。 表 2 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 10 允许的相对偏差/% ± 20 ±25 ±30 ± 50 7.2.5 空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 39 SN/T4816—2017 8结果计算和表述 用色谱数据处理仪或按式(1)计算，计算结果应扣除空白值。 AXc,×V V1000 X; = (1 ) A,Xm 1000 式中： X; 试样中被测组分含量，单位为微克每千克或微克每升（μg/kg或μg/L)； A; 样液中被测组分的峰面积； 标准工作溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)； Cs V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL)； A, 标准溶液中被测组分的峰面积； 最终样液所代表的试样质量，单位为克或毫升（g或mL）。 m 9 方法的性能指标 9.1 定量限 本方法各组分的定量限均为10μg/kg。 9.2 回收率 本方法回收率的实验数据参见附录C。 9.3精密度 本方法精密度的实验数据参见附录C。 10 结果判断 若禽类动物血清中磺胺类药物残留量超过400ug/kg，畜类动物尿液中磺胺类药物残留量超过 1250μg/kg，建议抽取动物肌肉组织进行残留量的确证。 4 SN/T4816—2017 附录A （资料性附录） 电喷雾离子源参考条件 质谱参考条件"： a） 雾化气GS1（NEB)：241.32kPa(35psi)（氮气）； b) 气帘气(CUR）：103.42kPa(15psi)（氮气）； 喷雾电压(IS)：5500V； c) d) 去溶剂温度（TEM)：620℃； e) 去溶剂气流GS2：137.90kPa(20psi)（氮气）； f) 碰撞气(CAD)：82.74kPa(12psi)（氮气）。 定性离子对、定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)见表A.1。 表A.1 定性离子对、定量离子对、去簇电压(DP）、碰撞能量（CE)、碰撞室出口电压(CXP) 碰撞室出 驻留时间 去电压 碰撞能量 摄人电压 序号 化合物名称 离子对 口电压 ms (DP)/V (CE)/eV (EP)/V (CXP)/V 311.1/156.2* 60 26 9 1 磺胺间二甲氧密啶 80 10 311.1/108.3 60 39 311.2/156.2* 56 31 80 2 磺胺邻二甲氧嘧啶 10 9 311.2/108.4 56 41 301.4/156.2* 54 25 3 磺胺喹恶啉 80 10 10 301.4/108.4 54 39 290.9/229.9* 60 35 9 4 三甲氧芋胺嘧啶 80 10 290.9/122.7 67 35 8 285/156.2* 42 23 5 磺胺氯哒嗪 80 10 10 285/108.4 45 35 50 26 281.2/156.2a 6 磺胺甲氧哒嗪 80 10 10 281.2/126 50 32 281.2/156.2* 50 25 7 磺胺-5-甲氧嘧啶 80 10 10 281.2/126 50 28 281.2/15