SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4817—2017 进出口食用动物中克伦特罗、 莱克多巴胺、沙丁胺醇残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of clenbuterol,ractopamine,salbutamol residues in edible animalforimport and export--HPLC-MS/MS method 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4817—2017 前言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张金玲、王凤美、梁广辉、郭礼强、孙军、颜显辉、张艺兵、赵丽青。 I SN/T4817—2017 进出口食用动物中克伦特罗、 莱克多巴胺、沙丁胺醇残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了进出口食用动物中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇残留量的液相色谱-质谱/质谱测 定方法。 本标准适用于进出口猪、羊、牛等动物毛发和血浆中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇残留量的 测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法原理 毛发样品经碱水解，有机溶剂提取浓缩，血浆样品用酶提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化， 液相色谱-质谱/质谱法测定，内标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙醇。 4.2氢氧化钠。 4.3 乙酸铵。 4.4 氯化钠。 4.5 叔丁醇。 4.6 冰乙酸。 4.7 甲醇：色谱纯。 4.8 正已烷：色谱纯。 4.9 乙酸乙酯：色谱纯。 4.10 甲酸：色谱纯。 4.11 氨水：25%~28%。 4.12 浓盐酸：36%~38%。 4.13 萃取溶液：150mL叔丁醇（4.5）与350mL乙酸乙酯（4.9）混匀。 4.14 β-葡萄糖醛武酶/芳基硫酸酯酶溶液：含β-葡萄糖醛武酶111000unit/mL；芳基硫酸酯酶 1 SN/T4817—2017 1 079 units/mL. 4.15乙酸铵缓冲溶液（2mol/L）：称取乙酸铵（4.3)77.0g，用水稀释并定容至500mL，混匀，加冰乙酸 (4.6)调pH为5.2。 4.16固相萃取（SPE)柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚 物，60mg，3mL，或性能相当者。使用前依次用5mL甲醇（4.7）、5mL水对柱子进行活化。 4.17洗脱溶液：50mL乙酸乙酯（4.9）、45mL甲醇（4.7)与5mL氨水（4.11）混匀。 4.18定容液：移取1mL甲酸（4.10），用水稀释并定容至1000mL，混匀。 4.19盒 氮气：纯度≥99.99%。 4.20标准品：盐酸克伦特罗（Clenbuterolhydrochloride），CAS编号：21898-19-1，纯度≥98.5%；盐酸 莱克多巴胺（Ractopaminehydrochloride），CAS编号：90274-24-l，纯度≥98.0%；硫酸沙丁胺醇（Salbu tamolsulfate)，CAS编号：51022-70-9，纯度≥99.0%。 4.21标准储备溶液（1000mg/L）：分别准确称取盐酸克伦特罗，盐酸莱克多巴胺、硫酸沙丁胺醇标准 品（折合成目标化合物10.0mg）（4.20），分别用适量甲醇溶解，并用甲醇定容至10mL。保存于一18℃ 冰箱，有效期12个月。 4.22标准中间液（1000μg/L）：用甲醇分别稀释盐酸克伦特罗，盐酸莱克多巴胺、硫酸沙丁胺醇标准 储备溶液（4.21）至1000μg/L，4℃以下避光保存，有效期为6个月。 4.23同位素内标物（100mg/L）：克伦特罗内标溶液（Clenbuterol-D9），浓度为100mg/L，溶剂为丙 酮；盐酸莱克多巴胺内标物（Ractopaine-D3-HCl)，纯度≥98.0%，准确称取盐酸莱克多巴胺内标物（折 合成目标化合物10.0mg），用适量甲醇溶解，并用甲醇定容至100mL，沙丁胺醇内标溶液（Salbutamol D3)，浓度为100mg/L，溶剂为丙酮。 4.24同位素内标中间溶液（1.0mg/L）：用甲醇分别稀释克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3 （4.23）至1.0mg/L。4℃以下避光保存，有效期为6个月 4.25标准工作液（10ug/L）：根据需要移取适量标准中间液、同位素内标中间液，用甲醇稀释，配制浓 度均为10μg/L的标准及其同位素内标工作液，该溶液临用前配制。 5仪器 5.1 液相色谱-质谱/质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI) 5.2分析天平：感量为0.01g和0.1mg 5.3旋涡混合器。 5.4冷冻离心机：最高转速大于或等于12000r/min。 5.5氮气浓缩仪。 5.6水浴振荡器。 5.7固相萃取装置。 5.8pH计。 5.9电热干燥器。 5.10水浴锅。 6样品制备 6.1毛发 将样品依次用热水、乙醇清洗，重复清洗三次后，用滤纸吸干。50℃电热干燥2h，将毛发剪碎至约 2mm，充分混匀，置于密封干燥处待测。 2 SN/T4817—2017 6.2血浆 取静脉血10mL，置人抗凝血试管中混匀，离心取上清于一18℃以下冷冻保存。 7测定步骤 7.1提取 7.1.1毛发 称取1g（准确至0.01g）样品至100mL-带螺旋盖聚丙烯离心管中，添加100μL同位素内标（4.25） 工作液，加人1mol/L氢氧化钠溶液20mL，旋紧螺旋盖，充分振荡混匀，80℃水浴2h，取出冷至室温， 用2mol/L盐酸调节pH至9.5～10，加氯化钠至饱和。然后加15mL萃取溶液（4.13）振荡混匀， 4℃条件下10000r/min离心10min，萃取两次，合并上层萃取液，30℃水浴条件下氮气吹干。加人 10mL乙酸铵缓冲溶液（4.15）溶解残渣，振荡混匀，待净化。 7.1.2血浆 准确移取1mL试样，置于50mL螺旋盖聚丙烯离心管中，添加100-μL同位素内标（4.25)工作液， 加人15mL乙酸铵缓冲溶液（4.15），然后加人20μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（4.14），充分振荡 混匀，37℃温育过夜。4℃条件下10000r/min离心5min，收集上清液于螺旋盖聚丙烯离心管中，样液 经滤纸过滤，并用2ml.乙酸铵缓冲溶液（4.15)洗涤滤纸，收集全部滤液待净化。 7.2净化 将7.1待净化溶液以低于1mL/min的流速过SPE小柱（4.16）再依次用5mL水，5mL甲醇， 5mL正已烷淋洗，真空抽干，最后用5mL洗脱溶液（4.17)洗脱，收集洗脱液，在30℃水浴条件下氮气 吹干。用0.5mL定容液（4.18）溶解，涡混均勾。样液过0.22um滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 液相色谱条件如下： a) 色谱柱：Cis柱，100mm×3.0mm（内径）粒度1.8μm或性能相当者； b) 进样量：10μL； c) 流速：0.35mL/min； d) 柱温：40℃； e) 流动相：A：甲醇，B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件见表1。 表1梯度洗脱程序表 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 15 8 0 3 60 40 5 60 40 5.1 15 85 8.5 15 85 SN/T4817—2017 7.3.2 质谱条件 质谱条件如下： a） 离子源：电喷雾离子源； 扫描方式：正离子扫描； 检测方式：多反应监测； (p 监测离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能参见附录A表A.1； 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体；使用前应调节气体流量以使 e) 质谱灵敏度达到检测要求；喷雾电压等电压值应优化至最佳灵敏度，参考质谱参数见表A.2。 7.3.3液相色谱-质谱/质谱测定 7.3.3.1定性标准 被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶 液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内；且样品谱图中被测组分监测离子的相对丰度与浓度接近的标 准工作溶液谱图中对应的监测离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中 存在对应的待测物。 表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的最大偏差/% ±20 ± 25 ± 30 ±50 7.3.3.2 定量测定 根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析。用标准工作曲 线按内标法定量，标准工作液和待测溶液中待测物的响应值在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件 下克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的保留时间参见附录A，标准溶液及空白基质的多反应监测（MRM) 色谱图参见附录B。 7.3.3.3空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。 结果计算 8 采用内标法定量，按式(1)计算克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇残留量，结果保留三位有效数字。 CXAAIV ￥1000 ...( 1 ) 式中： X--样品中待测组分残留量，单位为微克每千克或微升每升（ug/kg或者uL/L)； 标准工作溶液中待测组分的浓度，