SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4820—2017 牛瓜氨酸血症PCR-DHPLC检测方法 Detection method for bovine citrullinemia by PCR-DHPLC 2018-03-01实施 2017-07-21发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4820—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴晓薇、朱道中、刘志玲、刘中勇、李贺、马保华、段燕瑜、林志雄。 1 SN/T4820—2017 牛瓜氨酸血症PCR-DHPLC检测方法 1范围 本标准规定了牛瓜氨酸血症PCR-DHPLC的检测方法。 本标准适用了快速筛查牛群中隐性的牛瓜氨酸血症（参见附录A)基因携带者。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件.仪注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CN牛瓜氨酸血症（Citrullinemia) PCR聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction） DHPLC变性高效液相色谱（Denaturinghigh-performanceliquidchromatography） PBS磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersolution） TEAA三乙基铵醋酸盐（Triethylamincacctate） SNP单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism) 4原理 变性高效液相色谱(DHPLC)是利用目标核酸片段PCR扩增产物，部分加热变性后，含有突变碱基 的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区 比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来，从而达到分离的目的。 SNP的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异，依据此原理可很容易从色谱图中判断出突变的碱基 片段。 5仪器设备和试剂耗材 5.1仪器设备 变性高效液相色谱分析仪。 核酸扩增仪。 Ⅱ级生物安全柜。 恒温水浴锅。 高速台式离心机（转速可以达到12000r/min）。 微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）。 1 SN/T4820—2017 灭菌配套吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。 肝素钠抗凝管、Eppendorf管、微量移液器、八联管、移液器、离心管等 5.2 试剂与耗材 5.2.1 试剂级别：本方法试验用水应符合GB/T6682一2008规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。 5.2.2 DEPC水：按照附录B中B.1制备，推荐使用商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。 5.2.3 0.01mol/LPBS(pH7.6)，配方见B.2。 5.2.4 DHPLC缓冲液，配方B.3。 5.2.5 75%乙醇，配方见B.4。 5.2.6 dNTP:dATP、dTTP、dCTP和 dGTP。 5.2.7 pfu聚合酶。 5.2.8 酚/氯仿/异戊醇混合液。 5.2.9 10%SDS：配制方法见B.7。 6 引物与探针序列 上游引物(CN-F)5'-GTGTTCATTGAGGACATC-3 下游引物(CN-R)5"-CCGTGAGACACATACTTG-3 采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物配制成100μmol/L储存液，置一20℃保存；使用时取适 量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。PCR扩增的片段卡度大约为176bp(参见附录C)。 7样品采集、保存及运输 采集牛的抗凝血，冷藏储存与运输。 8 DNA提取 8.1 8.2混合液置于55℃水浴2.5h。 8.3向匀浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1)，轻轻震荡5min后12000r/min 离心5min。 8.4 吸上层水相400μL于一灭菌塑料离心管中，再次加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震 荡混匀5min，12000r/min离心5min。 8.5吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h；12000r/min 离心5min，倾去上清液。 温凉干。 8.7 向DNA沉淀中加100μLTE缓冲液，溶解沉淀一20℃保存备用。 注：DNA提取也可以采用等效组织DNA提取试剂盒，按照说明书进行。 9PCR扩增 采用50μL反应体系，分别取5μL基因组DNA作为模板，依次加人10×ReactionBuffer5μL， 2 SN/T4820—2017 dNTP4uL，上下游引物各1μL，pfu聚合酶2.5μL，加无菌双蒸水至50μL。扩增循环条件：94℃变 4℃保存。 10 异源双链的形成 分别取纯合型、野生型的PCR产物各5μL以1：1的比例混匀，制备成杂合子模型。将制备好的 杂合子模型置于PCR仪中在95℃变性5min，然后以1℃/min的速率缓慢降温到4℃，保存15min。 制备的杂合子模型，在变性缓慢复性的过程中就会形成异源双链以及同源双链，如果不及时用于 DHPLC分析，可先置于4℃保存。 11 DHPLC分析 11.1 1将扩增的野生型的PCR产物序列，导人WAVENavigatorsoftware的DNA界面进行分析，对序 列的描述为突变，填写和选择序列的突变类型、突变检测的方式。在DNA界面的method选项处设置 温度64.5℃建立CN-DHPLC分析方法。 11.2设置最佳流动相，其中A液为55.7%和B液为44.3%。取8μL变性缓慢复性后的PCR产物放 置在DHPLC金属板的微孔直接用于结果的分析。 12 设立对照 检测过程中应分别设CN野生型（C/C型）、CN杂合子(C/T型）作为分型对照。 13 结果及判定 13.1 质控标准 阴性对照：无特异吸收峰出现； CN野生型(C/C型）阳性对照：单一峰形； CN杂合子(C/T型）阳性对照：有肩峰且比野生型多出1个～2个峰形； CN野生型(C/C型）和CN杂合子(C/T型）阳性对照不出现上述的色谱峰视为实验无效。 13.2 2结果判定 当DHPLC分析色谱图中仅单一峰则判断为CN野生型（C/C型）阳性。 当DHPLC分析的色谱图中，与野生型色谱图进行鉴别比较，出现峰个数和峰的对称性改变则判断 为CN杂合子(C/T型）阳性。 当DHPLC分析的色谱图中，吸收峰值小于2mV时，建议对样品重做。重做结果的峰吸收值仍小 于2mV则判为阴性，应重新采集样品进行检测。 3 SN/T 4820—2017 附录A （资料性附录） 牛瓜氨酸血症概述 瓜氨酸血症（Citrullinemia，CN）又称精氨酸珀酸合成酶缺失症（Bovineargininosuccinatesyn thetasedeficiency），该病最早于1986年在澳大利亚的荷斯坦牛群中发现。 CN的遗传学基础是奶牛第11号染色体的编码精氨酸合成酶的ASS基因第5外显子的第86号氨 基酸发生单碱基突变（C-→T)，第86位氨基酸突变为终止密码子，从而其翻译产物精氨酸琥珀酸合成酶 变成了截短了的85个氨基酸的短蛋白（正常为412个氨基酸）而失去活性。同时，ASS基因也丧失了 AvaⅡI酶切位点。 瓜氨酸血症是使得荷斯坦奶牛尿循环发生代谢紊乱的一种常染色体单基因隐性遗传缺陷病。病牛 体内由于缺乏尿素代谢过程中的关键酶精氨酸琥珀酸合成酶，导致瓜氨酸不能转变为精氨酸琥珀酸而 大量积蓄于组织及血液中，引起机体内尿代谢紊乱。这一代谢紊乱的发生使体内代谢生成的瓜氨酸前 体氨无法转变为尿素排出体外，从面使对机体有毒的氨大量积蓄于组织及血液中，引起机体发病 患牛的临床症状表现为：底物瓜氨酸在体液和组织中贮积，造成高氨血症、高瓜氨酸血症、低精氨酸 血症，脑实质尤其是大脑皮质充血和水肿，神经元变性、坏死以及脂肪肝等损害。由于母体可以排出胎 儿代谢产生的氨，发病个体在胎儿期间或刚出生时表现正常，但出生后不久便表现出一系列临床症状， 如精神沉郁、步态紊乱、抽搐、惊厥、失明、虚脱等， CN野生型（C/C型）：正常牛基因型。 CN杂合型（C/T型）：CN基因携带者杂合子。 SN/T 4820—2017 附录B （资料性附录） DHPLC所用试剂的配方 B.1 DEPC处理的灭菌双蒸水配制 灭菌双蒸水100mL，加人DEPC50μL，室温过夜，121℃高压15min，分装到1.5mL的无RNA 酶的1.5mL离心管中。 B.2 20.01mol/LPBS (pH7.6) 先配制A液、B液。 A液（0.2mol/LNaH,PO4溶液）：称取一水合磷酸二氢钠（NaH2PO。·H²O)27.6g，或二水合磷 酸二氢钠（NaH2PO，·2H.O)31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。 B液（0.2mol/LNazHPO，溶液）：称取十二水合磷酸氢二钠（NazHPO，·12H2O)71.6g，或二水 合磷酸氢二钠（NazHPO，·2H，O)35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。 称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸馏水定容至2L。 B.3 DHPLC缓冲液 A液：50mLTEAA和250μL乙睛混合，加双蒸水定容至1000mL； B液：50mLTEAA和250ml.乙