SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4823—2017 牛凝血因子X缺失症巢式 PCR 检测方法 Detectionmethod forbovinefactor XI deficiency by nestedPCR 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4823—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：马保华、刘中勇、李贺、贾广乐、吴晓薇、邱索平、朱事康、朱道中、刘志玲、 林志雄。 I SN/T4823—2017 牛凝血因子X缺失症巢式 PCR检测方法 1范围 本标准规定了牛凝血因子XI缺失症的巢式PCR检测方法。 本标准适用于牛凝血因子X缺失症（参见附录A）的筛查。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088 出入境动物检疫采样 3 缩略语 以下缩略语适用于本文件。 FXID 凝血因子XI缺失症（FactorXIdeficiency） nPCR 巢式聚合酶链式反应（Nestedpolymerasechainreaction） ACD 酸性柠檬酸葡萄糖溶液 PBS 磷酸盐缓冲液 DNA 脱氧核糖核酸 dNTP 脱氧核糖核苷三磷酸 TAE 核酸电泳缓冲液 试剂 4 4.1 ACD(配制见附录B)。 4.2 蛋白酶K。 4.3 10%SDS。 4.4 酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)混合液， 4.5 无水乙醇。 4.6 Tris饱和酚。 4.7 75%乙醇。 4.8 TE缓冲液。 4.9 PfuDNAPolymerase酶或TaqDNA聚合酶。 4.10 PCR Buffer。 4.11 dNTP。 4.12 2%的琼脂糖溶液。 4.13 DNA分子量标记物（Marker）。 SN/T4823—2017 5仪器与设备 5.1 高速离心机。 5.2 恒温水浴锅：保持水温37℃士1℃。 5.3 5.4 振荡器。 5.5 pH计。 5.6 PCR仪。 5.7 电泳仪。 5.8 凝胶成像仪或紫外透射仪。 6样品采集、处理、核酸提取 6.1样品采集与预处理 按照GB/T18088进行。采血500μL，采集的血样立即与ACD混和均匀，冷藏运输与保存。若血 免反复冻融。 6.2核酸提取 6.2.1将血液样品200uL，加人2mL塑料离心管中.加20μL蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1%，上 下颠倒混匀。 6.2.2混合液置于55℃，水浴2.5h。 6.2.3向匀浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（2524：1），轻轻震荡混匀5min， 12000r/min离心5min。 6.2.4吸上层水相800μL于一灭菌塑料离心管中，再次加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻 震荡混匀5min，12000r/min离心5min。 6.2.5吸上层水相500uL于塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放 置5min；12000r/min离心5min沉淀DNA，倾去上清液。 6.2.6向沉淀中加人75%乙醇溶液500mL轻轻混匀后12000z/mim离心5min，倾去上清液，室温凉干。 6.2.7向DNA沉淀中加100uLTE缓冲液溶解沉淀一20C保存备用。 注：DNA提取也可采用等效组织DNA提取试剂盒，按照说明书进行 7 巢式PCR 7.1 巢式PCR扩增引物 P1:5'-GTG TTG AAG GGT GGA AAA AGT ATT CAT TG-3' P2:5'-CTT TGC AGC CCT TCT CCC TTT TTA ATG-3' P3:5'-GTC GAG TCA CCT AAT GTG TTG-3' P4:5'-CCG TAC CTG TGT AAT TCA TTG TC-3' 引物储存浓度10umol/1.使用时终浓度为0.2umol/L。外部引物对（P1、P2)扩增产物长度为 540bp（616bp）；内部引物对（P3、P4）扩增产物长度为181bp(257bp）。 7.2对照设立 从样品处理开始，应设置FXID野生型对照、FXID突变型对照和空白对照 SN/T4823-2017 空白对照：在扩增反应阶段设置，以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。 7.3反应体系 采用25μL反应体系，按照表1配制。 表 1 引物（浓度为10pmol/L) 上下游引物各0.5μL 10× Pfu Buffer 2.5 μl, dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 μL, PfuDNAPolymerase酶或TaqDNA聚合酶(2.5U/μL) 0.25 μL ddH,O 18.25 μl, 模板DNA 1 (μL 可采用其他等效商品化PCR反应试剂，PCR缓冲液、Taq酶等用量按照试剂说明书使用， 7.4初始PCR 将PCR管放人PCR仪，反应条件设定：94℃预变性3min；94℃变性30s，66℃退火30s，68℃延 伸20s.30个循环68℃10min。 7.5巢式PCR扩增 以第一次PCR产物稀释100倍作为第二次PCR反应的模板。 将PCR管放入PCR仪反应条件设定：94℃预变性3min；94℃变性30s，58.8℃退火30s，67℃ 延伸15s30个循环；67℃10min。 7.6电泳检测 使用2%琼脂糖凝胶，采用Goldview或其他等效核酸染料。设DNAMarker，5V/cm～8V/cm， 电泳1h，用凝胶成像系统仪或紫外透射仪观察，拍照记录检测结果。 8结果分析与判定 8.1对照结果 阴性对照未出现预期大小的扩增条带；空白对照未出现预期大小的扩增条带；阳性对照出现预期大 小的扩增条带。以上指标有一项不符合，本次实验无效，需要重做。 8.2检测结果判定 套式PCR后，若只得到181bp左右的条带.则可判断为检测结果阴性，样品不是FXID携带者。 则可判断为FXID杂合型；这两种结果都表明样品是FXID携带者。 8.3巢式PCR检测结果的确证 可对巢式PCR扩增产物进行测序确证。因突变型序列的76bp插人的核苷酸序列主要由腺嘌呤 （A)构成，测序信号较易发生中断，采用P3、P4两条引物同时测序，对结果进行拼接，对测序结果运用计 算机软件进行分析。将所测得的序列与标准序列（参见附录C)进行比较，序列吻合（扩增区全序列比对 同源性达95%以上）表明确证为阳性。 3