SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4853.42017 转基因大米定量检测 数字 PCR 法 第4部分：M12品系 Quantitative detection of genetically modified rice--Digital PCR- Part 4:Event M12 2018-03-01实施 2017-07-21发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4853.42017 前 言 SN/T4853《转基因大米定量检测 数字PCR法》系列标准共分为7部分： 第1部分：TT51-1品系； 第2部分：克稻品系； -第3部分：科丰6号品系； 第4部分：M12品系； 第5部分：LL62品系； 第6部分：T2A-1品系； -第7部分：T1C-19品系。 本部分为SN/T4853标准的第4部分。 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共 和国吉林出境检验检疫局。 本部分主要起草人：聂丹丹、陈颖、黄文胜、邓婷婷、朱水芳、吴亚君、付伟、韩建勋、李想。 I SN/T4853.4—2017 转基因大米定量检测数字PCR法 第4部分：M12品系 1范围 本标准规定了稻谷和大米中M12品系的数字PCR定量检测方法。 本标准适用于稻谷和大米中M12品系特异性的数字-PCR-定量检测。 本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T19495.5转基因产品检测 核酸定量PCR检测方法 GB/T19495.7转基因产品检测 抽样和制样方法 SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 SPs基因Thegeneof sucrosephosphatesynthase 蔗糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。 3.1.2 M12转化体特异性序列 event-specificsequenceofM12 外源DNA插人受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。 3.1.3 Taq酶TaqDNApolymerase 源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。 3.1.4 模板template 数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。 1 SN/T4853.4—2017 3.1.5 定量检测低限limitofquantification;LOQ 在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。 3.1.6 质控样品 qualitycontrol sample 具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的基因组DNA。 3.1.7 微反应体系 tiny reaction system 将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀勾之后分配至体积相同且相互 物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。 3.1.8 转换系数 Conversionfactor 将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量（质量分数)时所用系数。 3.1.9 荧光标记探针Fluorescentlytaggedprobe 在5'末端和3'末端分别连接荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。PCR扩增时，Taq酶的5'-3 外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerasechainreaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） bp：碱基对（basepair） NC：阴性对照（negaitivecontrol) NTC：空白对照（notemplatecontrol） PC：阳性对照（positivecontrol) 4防污染措施 数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。 5原理 数字PCR(digitalPCR)是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板 的绝对拷贝数的测定。通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反 应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机 地分配至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定 的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字 PCR反应体系中的模板浓度。 依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（eventspecificsequence）和内参照基因（specics specificgene)的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量。 2 SN/T4853.4—2017 5仪器和设备 6 6.1超纯水发生器（分子生物学级别）。 6.2分析天平：感量0.1g和0.1mg。 6.3生物安全柜。 6.4PCR扩增仪。 6.5 数字PCR系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具 有同样功能的仪器。 6.6恒温孵育箱：控温精度土1.0℃。 6.7 样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60目左右的粉末。 6.8 核酸定量仪：Nanodrop3ooo或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪。 6.9 涡旋振荡仪。 6.10 离心机：最大离心加速度大于15000g，并适用0.2mL和1.5mL离心管。 6.11 移液枪：量程0.5μL～10μL量程10μL100μL；量程100μL~1000μL。 试剂和材料 除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T19495.1的要求。 7.1 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5'-3'外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字 PCR专用预混试剂。 7.2引物和探针：SPS基因和M12转化体特异性序列的数字PCR检测引物和探针信息详见表1。 7.3 数字PCR微反应体系生成联排管或芯片。 7.496孔荧光定量PCR反应板和封膜。 7.50.2ml和1.5mL离心管。 7.6 移液枪头，量程0.5μ～10μ；量程10μl～100μL；量程100μ～1000μ。 表1SPS基因和M12转化体特异性序列的引物和探针 扩增基因 名称 序列（5'-3') PCR扩增片段长度 上游引物 GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG SPS基因 下游引物 GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC 122bp 探针 VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1 上游引物 GAGAACAAGAAGCCCCTTCTGTCTCG M12转化 下游引物 AAGGTACTAAAGCTTGAAAATCCTAAGGC 89bp 体特异性序列 探针 FAM-CACATTCGGCAGTGAAACTCTTGAGCGCC-BHQ1 注1：表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整。 注2：荧光探针的发光基应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5'-FAM/3'-BHQ1或5'-VIC/3'-BHQ1方 式标记。 注3：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至 10umol/L后分装，一20℃避光保存。 3