SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4864—2017 转基因玉米检测 微流体芯片检测方法 Transgenic maize detection-Taqman array card method 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4864—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、LifeTechnologiesBrand、Thermofisher ScientificCorp、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：徐君怡、曹际娟、YaleiWu、郑秋月、徐杨、那晗、JennyXiao、贺艳、王建新、 黄志、陈大军。 SN/T4864—2017 转基因玉米检测 微流体芯片检测方法 1范围 本标准规定了食品中转基因玉米TC1507、NK603、MON87640、MON863、MON810、MIR162、 品系的微流体芯片检测方法。 本标准适用于玉米及其加工产品中转基因玉米TC1507、NK603、MON87640、MON863、MON810、 MIR162、GA21、DAS40278、BT176、BT119814059122、3272,MON89034、MIR604、MON88017、T25 等17个品系的定性筛查检测。 本方法的定性检测低限为1%（质量分数）。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 转基因 transgene 行表达，以便该物种获得新的品种特征。 3.2 内源基因 endogenousgene 在栽培的物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于对基因组中某一目的 基因的定量分析。 3.3 外源基因 exogenousgene 利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。 4 方法原理 TaqMan技术是一种应用于核酸实时PCR检测的专利技术。该技术使用根据靶标核酸设计合成 的DNA单链，并在单链的两端分别偶联上荧光报告基团和荧光淬灭基团，此结构称为TaqMan探针。 1 SN/T4864—2017 在PCR扩增的过程中，TaqDNA聚合酶会切断特异性结合在靶标DNA链上的TaqMan探针，使 得探针的荧光报告基团发出特定波长的荧光，实现DNA分子的扩增与反应体系发出的荧光增长具有 高度的一致性同步。通过荧光检测仪器，即可在PCR扩增的过程中，实时地检测或者定量反应体系中 的DNA分子数目。 TaqMan微流体芯片将TaqMan探针包埋于微流体芯片检测卡中，使用TaqMan技术进行检测。 仪器设备和主要试剂 5 5.1 仪器设备 高速冷冻离心机；水浴培养箱；天平：感量0.001g；TaqMan微流体芯片兼容PCR仪（适用的机型 包括7900fastHT、ViA7、QuantStudioQ7、QuantStudio12K）；带有离心适配器的高速离心机；超净 工作台；制冰机；核酸蛋白分析仪；低温冰箱；纯水器或双蒸水器；旋涡振荡器；微量进样器（0.5μL、 2 μL、100μL)。 5.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格：TaqMan微流体芯片检测卡；氯仿；异戊醇；异丙 醇：70%乙醇；CTAB裂解液：3%CTAB（质量与体积的比值），1.4mol/LNaCl，0.2%（体积分数）巯基乙 醇，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl,pH8.0；TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl,pH8.0； 1mmol/LEDTA,pH8.0。 6检验方法 6.1P 防污染措施 TaqMan微流体芯片检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。 6.2抽样制样 按照GB/T19495.7的规定执行。 6.3 3核酸提取纯化 荡保温1h：2000r/min离心5min；取上清液，加等体积氯仿/异戊醇（体积比：24/1）混匀，静置5min， 8000r/min离心5min；小心取离心上清液，再加等体积氯仿/异戊醇（体积比：24/1）混匀，静置5min， 8000r/min离心5min；取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇，混匀，12000r/min4℃离心10min；弃 上清液，加500μL70%冰乙醇洗涤一次，12000r/min4℃离心5min；弃上清液，将沉淀晾干，加人 50μLTE，溶解沉淀（4℃过夜，或37℃保温1h）；此即为总DNA提取液。 也可用相应市售DNA提取试剂盒提取DNA，或按照GB/T19495.3执行。 6.4TaqMan微流体芯片检测方法 6.4.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 检测过程中应按照GB/T19495.2中的规定设置对照。 阴性目标DNA对照：不含外源目标核酸序列的DNA片段。 2 SN/T4864-2017 阳性目标DNA对照：参照DNA，或从可溯源的标准物质提取的DNA，或从含有已知序列阳性样 品（或生物）中提取的DNA。 扩增试剂对照：该对照包括除了测试样品DNA模板以外所有的反应试剂，在TaqMan微流体芯片 反应体系中用相同体积的水（不含核酸）取代模板DNA。 6.4.2 TaqMan微流体芯片反应体系 TaqMan微流体芯片反应体系见表1，转基因玉米品系筛查检测所需的引物、探针信息见附录A。 表1TaqMan微流体芯片反应体系 试剂名称 μL/反应 2×TaqManEvironmental MasterMix2.0 50 DNA模板（60ng/μL~100ng/μL） 5 补水至 100 注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量；也可根据具体情况或不同的反应 总体积进行适当调整。 6.4.3TaqMan微流体芯片的工作流程 6.4.3.1 上样 将样品核酸和PCR预混液混合后，用移液器将100μL该溶液直接加人TaqMan微流体芯片的加 样孔即可。每张芯片，根据定制的格式不同，可以加人1个～8个样品的反应液。 6.4.3.2 离心进样 将TaqMan微流体芯片放人专用的离心适配器中，在331g的吊桶式转头下离心两次，每次1min。 通过此步骤，PCR反应液均匀地分配到384个PCR反应腔中。 6.4.3.3封口 TaqMan微流体芯片配备专用的封口器，可对进样后的芯片进行封闭处理：将芯片上各反应腔体的 通路封闭，形成384个彼此独立的反应室。 把待封口的芯片按照指定朝向放人封口器，手握封口器把手，平缓地把把手由起始位置推到封口结 束位置，随后将芯片取下，用剪刀将芯片突出的加样部分剪除即可完成对芯片的封口处理。 6.4.3.4 上机运行 TaqMan微流体芯片的运行需要配合兼容的PCR模块（Block）和热盖（HeatCover），适用的机型 为7900fastHT，ViiA7、QuantStudioQ7、QuantStudio12K，共4种。反应按照以下条件进行：50℃ 2min95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。 6.4.4 结果分析 6.4.4.1 基线的设置 TaqMan微流体芯片实时荧光PCR反应结束并分析结果后，应设置无效基线范围。无论采用任何 荧光通道（FAM或VIC），基线范围选择在3个～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整 3 SN/T48642017 基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性目标DNA对照扩增曲线的最高点，且Ct值=40为 准（阈值一般是基线标准偏差的10倍）。 6.4.4.2 2Ct值与DNA浓度的关系 Ct值大于或等于40时，PCR过程中无目标DNA的扩增；Ct值在35～40之间，且平行样的每个值 之间的差异很大，表明PCR反应体系中的目标DNA量很少，应适当增加模板量。 6.4.4.3TaqMan微流体芯片实时荧光PCR检测的质量控制 扩增试剂对照（NTC对照）：外源基因检测Ct值大于或等于40，内源基因检测Ct值大于或等 于40。 阴性目标DNA对照（非转基因样品对照）：外源基因检测Ct值大于或等于40。 阳性目标DNA对照（阳性对照）：外源基因检测Ct值小于或等于35。 上述指标有一项不符合者，应重做实时荧光PCR扩增。 7 结果判定 正常者，则可判定该样品未检出×××转基因玉米品系。 待测样品外源基因检测Ct值小于或等于35，内源基因检测Ct值小于或等于28，设置的对照结果 正常者，则可判定该样品检出×××转基因玉米品系。 待测样品外源基因检测Ct值在35~40之间，应适当增加模板量，重做TaqMan微流体芯片实时荧 光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct小于40.且设置的对照结果正常，则可判定该样品检出 ×××转基因玉米品系；再次扩增后结果Ct值大于40，且设置的对照结果正常，可判定该样品未检出 XX×转基因玉米品系。 SN/T4864