SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4865—2017 大豆拟茎点种腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phomopsis longicolla Hobbs 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 刮涂层查真伪 SN/T4865—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：陈雪娇、李云飞、宗凯、姚剑、段维军、孙娟娟、郑海松。 SN/T4865—2017 大豆拟茎点种腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进出境大豆种子及其夹带的植物残体中大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsislongicolla Hobbs)的检疫鉴定方法。 本标准适用于大豆拟茎点种腐病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用手本文件。 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3基本信息 学名：PhomopsislongicollaHobbs 分类地位：半知菌亚门Deuteromycotuna，腔孢纲Coelomycetes.球壳孢目Sphaeropsidales，球壳孢 科Sphaeropsidaceae，拟茎点霉属Phomopsis。其有性态为间座壳属，自然界内未发现。 传播途径：随带菌种子、植株或残体的调运作远距离传播。 大豆拟茎点种腐病的地理分布、寄主、为害状等信息参见附录A 4原理 以大豆拟茎点种腐菌培养性状，形态特征及实时荧光PCR检测结果作为检疫鉴定的主要依据，寄 主、地理分布及为害症状作为辅助鉴定依据。 5仪器和用具 5.1仪器 生物显微镜（带显微照相装置）、体式显微镜、超净工作台、电子天平、光照培养箱、高压灭菌锅、实时 荧光PCR仪、高速冷冻离心机、金属浴、冰箱、移液器等。 5.2用具 培养皿、烧杯、三角瓶、镊子、手术刀、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯、挑针、滤纸、标签等。 6试剂和培养基 6.1试剂 75%酒精、85%乳酸、1%次氯酸钠、实时荧光PCR反应预混液、去离子水等。除另有规定外，所有 1 SN/T4865-2017 试剂均为分析纯。 6.2培养基 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：称取马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉18g，加入1000mL蒸馏 水后加热搅拌溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃后倒平板。 酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA）：按照PDA配方配制，高压灭菌后冷却至50℃，用过滤除菌的 85%乳酸调节pH至4.5后倒平板。 / 抽样方法 按照SN/T2122中的规定进行抽样。 8 鉴定方法 8.1 症状检查 搜集并检查样品中夹带的豆荚或茎秆上是否有沿着茎秆成行排列的黑色斑点，观察种子是否存在 皱缩、延长、开裂、扁平状，是否覆盖有白色霉层。 8.21 保湿培养 8.2.1种子保湿培养 选取疑似感病样品，用1%次氮酸钠处理60s进行表面灭菌，无菌水漂洗3次后，放在垫有三层灭 菌湿滤纸的培养Ⅲ中，25℃～28℃12h光照12h黑暗交替条件下保湿培养7天以上，观察是否出现 白色菌丝。 8.2.2APDA培养 挑取少量白色菌丝转到APDA上，25℃～28℃12h光照12h黑暗交替条件下培养，长出典型菌 落和产孢结构后，转接至PDA培养基上，待长出分生孢子后，观察分生孢子器、分生孢子梗、产孢结构 及分生孢子的形状，并测量大小。 8.3 实时荧光PCR检测 用大豆拟茎点种腐菌株作阳性对照，用非大豆拟茎点种腐菌的植物病原细菌DNA作阴性对照，用无菌 水作空白对照，进行实时荧光PCR扩增（见附录B）。 9病菌形态特征 大豆拟茎点种腐病菌的培养性状、形态特征及与近似种的区别见附录C。 10 结果判定 如分离菌的形态特征与附录C中描述的大豆拟茎点种腐病的特征相符，且实时荧光PCR检测结果 为阳性，即可判定为大豆拟鉴点种腐病菌PhomopsislongicallaHobbs。 2 SN/T4865—2017 11样品与菌种保存 分离得到的大豆拟茎点种腐菌转接在PDA培养基斜面上，待斜面表面长满菌丝后，置于4℃保存， 定期转接。有条件可进行冷冻干燥保存。检出大豆拟茎点种腐菌的样品妥善保存6个月。保存期满灭 活处理。 3 SN/T4865—2017 附录A （资料性附录） 大豆拟茎点种腐病菌相关资料 A.1分布 亚洲：韩国、中国。 美洲：美国、阿根廷。 欧洲：意大利、克罗地亚、希腊、前南斯拉夫 大洋洲：澳大利亚。 A.2寄主 苟麻Abutilontheophrasti、元宝械Acertruncatum、三裂叶豚草Ambrosiatrifida、Astererilis、 Caperoniapalustris、Desmanthusillinoensis、斑地锦Euphorbiamaculata、肠Ecliptaprostrata、大 地锦Euphorbia nutans、大豆GlycinemarIpomoealacunuse扁蓄萝Polygonum aviculare、皱叶酸模 Rumer crispus、Sida spinosa、茄子Solanum melongena、虹豆Vigna unguiculata、苍耳子Xanthium strumarium等。 A.3为害状 大豆拟茎点种腐病的主要症状表现为当植株进人成熟期，豆荚和茎秆明显枯萎，茎秆和豆荚上覆盖 有黑色的小斑点，这些斑点就是病原真菌的子实体，通常沿着茎杆上成行排列。气候不适宜时，病菌只 发生在茎秆的部分区域，发病区域接近土壤表面，处在茎秆的结点上。病斑有时也可在干扁的豆荚上呈 现无规则点状。受感染的种子显现出从无症状到症状明显不同的等级，外观健康的种子也能在种皮上 带菌，受感染但不表现症状。严重感染的种子皱缩、延长、开裂、扁平，并呈白垩状，部分或全部覆盖白色 霉层。感病种子常不发芽或发芽缓慢 1 SN/T4865—2017 附录B （规范性附录） 大豆拟茎点种腐病菌分子生物学检测 B.1菌株DNA的制备 挑取少量培养物置于1.5mL离心管中，加人300uL无菌去离子水，沸水浴20min。冷却后备用。 B.2 引物和探针 大豆拟茎点种腐病菌特异性引物及探针：pltef-F：5-AGCATCACTTTCATTCCCACTT-3'；pltef- 3’。引物和探针由提供商品化服务的公司合成。 B.3反应体系 用pltef-F、pltef-R和pltef-P对模板DNA进行实时荧光PCR反应，反应体积20μL：2×PCR反应 预混液10μL、10μM引物和探针各1μL、模板2mL，无菌去离子水补足至20μL。将反应体系混匀后 置于实时荧光PCR仪中进行反应。 以无菌去离子水为空白对照，以大豆拟茎点种腐病菌DNA为阻性对照，以不含有大豆拟茎点种腐 病菌DNA的模板为阴性对照，每个样品重复2次。 B.4扩增条件 94℃5min；94℃15s；60℃30s:40个循环 B.5结果判读 在阳性对照能够正常扩增的前提下若待检样品扩增结果Ct值小于35，则判定实时荧光PCR检 测结果为阳性；若待检样品扩增结果Ct值大于或等于35，则重新制备浓度较高的DNA模板，重新扩 增。再次扩增后，若待检样品Ct值仍大于或等于35，则判定该样品实时荧光PCR检测为阴性；若待检 样品Ct值小于35，则判定该样品实时荧光PCR检测为阳性。