SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4877.5—2017 基因条形码筛查方法 第5部分：检疫性拟茎点霉 DNA barcoding screening method--Part5:Quarantine Phomopsis spp 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4877.5—2017 言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体； 第4部分：检疫性茎点霉； 第5部分：检疫性拟茎点霉； 第6部分：检疫性嗜酸菌； 第7部分：检疫性轮枝菌； 第8部分：检疫性炭疽菌； 第9部分：检疫性腥黑粉菌； 第10部分：检疫性疫霉。 本部分为SN/T4877的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学技术研究院、中华人 民共和国宁波出人境检验检疫局、中国科学院微生物研究所。 本部分起草人：黄国明、胡佳续、段维军、赵文军、蔡磊、高雅惠、廖芳、罗加风、张莹。 1 SN/T4877.5—2017 基因条形码筛查方法 第5部分：检疫性拟茎点霉 1范围 SN/T4877的本部分规定了大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、向日葵茎溃疡病菌、黄瓜 黑色根腐病菌等4种检疫性拟茎点霉DNA-条形码筛查方法。 本部分适用于进境植物及其产品中大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、向日葵茎溃疡病 菌、黄瓜黑色根腐病菌等4种检疫性拟茎点霉的筛查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1899大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法 SN/T2589植物病原真菌检测规范 SN/T3423黄瓜黑色根腐病菌检疫鉴定方法 SN/T3432向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 凭证标本voucherspecimen 为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本，它可以 是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。凭证标本的保存非常重要，需要有详细的 标本编号、存放地点等详细信息，以便于日后查证。 3.2 DNA条形码DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.3 内部间隔转录区序列Internaltranscribedspacer；ITS 用于鉴定拟茎点霉属病原真菌的DNA条形码：内部间隔转录区序列（Internaltranscribedspacer， 简称ITS），在rDNA基因中18SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为（ITS），它的长度和序列变化 较大，将其扩增物进行序列分析，可用于对植物病原真菌的属、种、甚至种下阶元进行分类鉴定。 4检疫性拟茎点霉基本信息 农业部和国家质检总局2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫 性有害生物名录》中将植物病原真菌拟茎点霉属（Phomopsis）中的大豆北方茎溃疡病菌Diaporthe SN/T4877.5-2017 phaseolorum(CookeetEll.)Sacc.varcaulivoraAthowetCaldwell(无性态为Phomopsisphaseoli）、大 豆南方茎溃疡菌Diaporthephaseolorum（CookeetEll.)Sacc.var.meridionalisF.A.Fernandez(无性态 为Phomopsisphaseoli）、向日葵茎溃疡病菌DiaporthehelianthiMuntanola一CvetkovicMihaljcevic etpetrov(无性态为PhomopsishelianthiMunt.-Cvetk.，Mihalijc.&M.Petrov）、黄瓜黑色根腐病菌 PhomopsissclerotioidesvanKesteren、蓝莓果腐病菌DiaportheuacciniiShear（无性态为Phomopsis vacciniiShearN.E.Stevens&H.F.Bain）、苹果果腐病菌DiaportheperniciosaE.J.Marchal(无性态为 Phomopsisprunorum（Cooke)Grove）、列为我国禁止进境检疫性有害生物。 大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方基溃疡病菌、向日葵茎溃疡病菌、黄瓜黑色根腐病菌相关分类地位、 传播途径等信息分别见SN/T1899、SN/T3432、SN/T3423。 5方法原理 根据拟茎点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ITS)序列特征，将序列在DNA条码数据库和NCBI数 据库中拟茎点霉属ITS序列进行同源性比对，应用DNA条形码技术对检疫性拟茎点霉进行种类筛查。 本标准建立的方法不应完全取代形态学和其他分子生物学等鉴定方法，而应作为形态学和其他分 子生物学鉴定方法的一种补充，相互佐证。 6仪器设备和主要试剂 6.1仪器设备 生物显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度 仪、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、常规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、测序仪、全自动 DNA提取仪。 6.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。应购置如下试剂或者相应的真菌基因组提取试剂盒：二水合 乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA·2H，O）、氢氧化钠（NaOH）、Tris碱、浓盐酸（HCI)、漠化十六烷基三甲 铵（CTAB）、氯化钠（NaCI）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、冰醋酸（CH：COOH）、蒸馏水、氮仿（CHCI:）、异戊 醇、70%乙醇。 PCR和电泳检测所需试剂：10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ErTaqDNA聚合 酶、引物（表B.1）、超纯水、DNA标记物、琼脂糖、GelRed核酸凝胶染料。 7DNA条形码鉴定 7.1样品的采集与处理 样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。 7.2核酸的制备 采用市售基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的CTAB提取法（参见附录A）。 7.3DNA纯度与浓度的测定 用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核 2 SN/T4877.5-2017 酸的纯度和浓度，计算公式如下： DNA纯度=OD260/OD280 DNA浓度=50×OD260（μg/mL） PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7～1.9。 7.4PCR检测 7.4.1PCR扩增 引物序列、PCR扩增体系、PCR反应程序参见附录B。 7.4.2PCR产物的检测和测序 5μL的PCR产物与1uL的6×上样缓冲液混合，120V下电泳，染色后在凝胶成像系统中观察目 的片段并成像留存，对扩增产物进行序列测定，测序引物为通用测序引物M13F-47和M13R-48，或者直 接将PCR扩增产物直接送专业测序公司测序。 7.5 序列分析 测序结果利用生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物 部分序列。利用NCBI在线数据库和BOLD在线数据库中比对ITS片段序列。 8结果判定 ITS序列长度约为700bp，若与DNA条码数据库和NCBI数据库中拟茎点霉属ITS序列同源性 大于99%，且菌落特征、寄主等与相关行业标准相符，即可判定为该物种。 9样品保存 9.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出检疫性拟茎点霉的样品应保存于4℃冰箱中，以备 复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。 9.2菌株保存与处理 对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 9.3结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、方法和结果等，并要有实验人员和复核 人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。